siRNA c-Met腺病毒轉染對人外泌汗腺上皮細胞增殖的影響

[摘要]目的:研究siRNA c-Met腺病毒轉染對培養的人外泌汗腺上皮細胞(human eccrine sweat gland epithelial cells，hESGc)增殖的影響。方法:按我科已經建立的方法培養和鑒定hESGc，取第1代細胞備用。構建表達紅色熒光蛋白的siRNA c-Met腺病毒， 熒光顯微鏡觀察和Westernlot檢測證實病毒的有效性。MTT法檢測siRNA c-Met腺病毒對hESGc增殖的影響。結果:熒光顯微鏡下可見轉染了siRNA c-Met腺病毒的hESGc有紅色熒光表達，轉染后48h，收集細胞進行westernblot檢測，結果發現，siRNA c-Met腺病毒轉染能抑制hESGc細胞中c-Met蛋白的表達，抑制率達70%以上，MTT法檢測發現轉染siRNA c-Met腺病毒能抑制hESGc增殖，抑制率分別為16.8%(2天)和34.5%(4天)。結論:siRNA c-Met腺病毒轉染能抑制hESGc的增殖。

[關鍵詞]c-Met;外泌汗腺;上皮細胞;增殖

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)09-1324-03

Inhibitory effects of knockdown of c-Met by Adenovirus-delivered siRNA on growth of human eccrine sweat gland epithelial cells

LEI Xia1， LIU Bo2， WU Jin-jin1， LU Yuan-gang1， Yang Ya-dong1

(1. Department of Dermatology， Daping Hospital，Third Military Medical University， Chongqing， 400042，China;2. Department of Orthopadics， the First Affiliated Hospital， Chongqing Medical University)

Abstract: ObjectiveTo investigate the effect of siRNA c-Met adenovirus on proliferation of cultured hESGc.Methods The recombinant adenoviral vector containing siRNA targeting c-Met gene was successfully constructed. Adenovirus with high titer was harvested. Fluorescence microscope observation and westernblot test were used to confirm the effectiveness of adenovirus. MTT assay was used to detect the growth of the cells.ResultsRed fluorescence was observed in hESGc infected with siRNA c-Met adenovirus under fluorescence microscopy.The infected cells were harvested for westernblot test. It is observed that c-Met was inhibited in siRNA c-Met adenovirus infected cell group. The transfection of siRNA c-Met adenovirus can inhibit the growth of hESGc by MTT assay.The inhibition rate were 16.8% in 2 days and 34.5% in 4 days.ConclusionThe transfection of siRNA c-Met adenovirus can inhibit the growth of hESGc.

Key words:c-Met; eccrine sweat gland; epithelial cell; proliferation

C-Met是至今唯一被認識的肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)高親和力受體，由c-Met基因編碼，HGF與c-Met結合后，可誘導其發生構像變化，進而激活磷酸化通路，逐級放大信號，從而發揮HGF的生物學效應。不少實驗表明，HGF/c-Met信號通路與多種細胞增殖，器官發生，腫瘤生長和轉移等生物學行為有關[1]。已有實驗表明，人外泌汗腺上皮細胞(Human Eccrine Sweat Gland Epithelial Cells，hESGc)上存在c-Met受體，加入HGF能促進hESGc增殖[2]，但下調c-Met表達對hESGc的影響尚不明確。RNA干擾是一種新興的基因抑制技術，原理是通過設計小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)，介導序列高度同源的靶基因mRNA降解，下調靶基因表達[3]。本文擬利用重組腺病毒介導的siRNA技術下調c-Met表達對hESGc體外增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑:無血清角質形成細胞培養基(keratinocyte serum free medium，KSFM)和DMEM培養基購自美國Gibco 公司， FITC-Annexin V試劑盒購自美國Trevigen公司，抗Marker 相對分子質量標準品和兔抗c-Met多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，鼠抗β-actin 抗體購自美國Novus 公司，其他分子生物學試劑購自美國Sigma 公司，pSES-HUS及腺病毒骨架質粒pAdEasy-1， 由美國芝加哥大學分子腫瘤實驗室TC. He教授惠贈;限制性內切酶Sfi I， EcoRV， KanI， PmeI，PacI和T4 DNA連接酶 購自美國TaKaRa 公司和New England Biolabs(NEB)公司，Wizard Plus質粒純化系統購自美國Promega 公司;Bio-Tek多功能讀板機購自美國Bio-Tek Synergy HT公司，CKX41-32PH 型倒置相差顯微鏡及照相系統購自日本Olympus 公司，BioImaging Systems購自美國UVP 公司，FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2實驗方法

1.2.1 細胞培養:hESGc在KSFM 中按我科已經建立的方法培養和鑒定[2]，取第1代細胞備用。

1.2.2 重組腺病毒載體的構建:從GenBank中檢索到c-Met的cDNA序列(登錄號:NM-000245)，按照siRNA設計的原則選取靶序列。正義鏈5'-AGGACAATGATGGCAAGAAATTTT-3'，反義鏈5'-ATTTCTTGCCATCATTGTCCTTTT--3'。參照He等[4-5]的方法先構建腺病毒穿梭質粒pSES-siRNA-c-Met，經Pme I 酶切線性化后，與病毒骨架質粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中進行同源重組，再經Pac I酶切純化后轉染HEK293細胞包裝出重組腺病毒，經熒光顯微鏡下觀察紅色熒光表達，即為構建成功，命名為AdR-siRNA c-Met，于HEK293細胞中擴增。取僅含有紅色熒光蛋白RFP的空病毒(Ad-RFP)做對照。

1.2.3 SiRNA met腺病毒轉染hESGc細胞:第1代的hESGc細胞接種于6孔板，KSFM培養，細胞的密度約60%～80%時，測定hESGc細胞的最適感染復數，每孔分別加入AdR-siRNA c-Met 0μl、2μl、4μl、8μl、16μl、48h后，在熒光顯微鏡下觀察，統計表達RFP的細胞百分比(感染效率)，取感染效率80%以上，同時細胞沒有明顯由病毒本身引起的細胞毒現象的病毒量，最終確定為4μl AdR-siRNA c-Met病毒液/孔。同理對照組Ad-RFP合適的病毒量亦為4μl Ad-RFP病毒液/孔。由于培養hESGc細胞時，6孔板每孔中培養基約1ml，故適合用于轉染的病毒濃度為4μl病毒原液/ml培養基。

1.2.4 Westernblot檢測: 培養14h后，細胞用PBS洗兩遍后，加入新鮮的KSFM培養基，轉染后48h，取細胞做westernblot檢驗，明確AdR-siRNA c-Met的有效性。設置對照組(無影響因素)，陽性對照組(Ad-RFP轉染)和實驗組(AdR-siRNA c-Met轉染)，在轉染后48h收集各組細胞，加入RIPA細胞裂解液，超聲破碎細胞，提取各組細胞總蛋白并采用BCA定量，取等量總蛋白(40μg)上樣，電泳，電轉， 5%脫脂牛奶封閉3h， 加一抗(兔抗c-Met多克隆抗體，小鼠抗β-actin 抗體)，室溫孵育2h，洗膜，加二抗(抗兔IgG-HRP，抗小鼠IgG-HRP)，室溫孵育1h，洗膜，化學發光法檢測，曝光，顯影，定影，記錄實驗結果，Western blot 法測得所有數據均采用UVP BioImaging Systems 采集，將X 線片掃描后的圖像數據輸入LabWork 3.0 軟件進行圖像分析，將內參β-actin 作為標準積分吸光度(standard integral absorbance，SIA)，各目的條帶相對積分吸光度值(relativeintegral absorbance，RIA)=樣本積分吸光度值(integral absorbance，IA)/ SIA。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖: 實驗分成4組，空白組，對照組，陽性對照組和實驗組。空白組不含細胞，僅于96孔板加入200μl KSFM，對照組，陽性對照組和實驗組均于96孔板按 2×103個/孔接種hESGc，對照組每孔加入200μl KSFM，陽性對照組每孔加入含4μl /mL Ad-RFP 腺病毒的KSFM 200?l，實驗組每孔加入含4μl /ml AdR-siRNA c-Met 的KSFM 200μl 。每一組每一時相點設六復孔。各組在0天，2天，4天時采用MTT法檢測細胞增殖情況。從孵箱中取出待測96 孔板，每孔加入MTT 溶液(5g/L)20μl，繼續培養4h，棄上清，每孔加入DMSO 100μl，振蕩10min，在Bio-Tek 多功能讀板機570 nm 波長測定吸光度(A)值，并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(陽性對照組A 值-實驗組A 值)/ 陽性對照組A值×100%。

1.2.6 統計學方法:采用SPSS11.0 統計軟件包進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK，P值<0.05 為有統計學意義。

2結果

2.1 SiRNA c-Met重組腺病毒轉染hESGc:所構建的pSES-HUS-siRNA c-Met干擾序列由美國芝加哥大學醫學中心測序中心測序，包含目的基因在內的序列正確。hESGc細胞轉染了AdR-siRNA c-Met后，熒光顯微鏡下可見紅色熒光蛋白表達(見圖1)。

2.2 Westernblot檢測:hESGc細胞轉染AdR-siRNA c-Met后48h，收集細胞進行westernblot檢測，結果發現，AdR-siRNA c-Met轉染能抑制hESGc細胞中c-Met蛋白的表達(見圖2)，通過UVP BioImaging Systems 采集圖像后分析發現，對細胞中c-Met蛋白的抑制能達到70%以上。

2.3 MTT 法檢測細胞活力:在加入腺病毒轉染之前，各組間A 值比較差異無統計學意義(P>0.05)。腺病毒轉染hESGc后，2天，4天均能抑制細胞的增殖，實驗組A值與陽性對照組和對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，抑制率分別為16.8%(2天)和34.5%(4天)，但對照組與陽性對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

3討論

HGF是一個多效應生長因子，具有多種生物活性，參與機體多種器官組織細胞生長、再生和重塑，研究表明，HGF對多種細胞均有促進增殖和運動的作用，如BMSCs、平滑肌細胞、牙髓細胞、腎小管上皮細胞、角膜上皮細胞以及視網膜上皮細胞等[6-8]。c-Met是HGF特異性受體，其在組織中廣泛存在，但是上皮細胞中表達濃度最高[9]。HGF與c-Met結合后，可誘導其發生構像變化，激活受體胞內蛋白激酶結構域中的蛋白酪氨酸激酶(PTK) ，使受體自身的酪氨酸殘基磷酸化而激活受體[10]。除自身磷酸化外，c-Met 蛋白的酪氨酸激酶活性可導致多種底物蛋白的酪氨酸磷酸化，經瀑布式磷酸化反應，將信號逐級放大，最終轉入細胞核內的轉錄機構，導致細胞的增殖、分化[11]。

汗腺起著排汗，調節體溫，物質交換等重要作用，深入研究汗腺細胞的生物學行為的影響因素，對揭示汗腺及其他管狀系統的發育和功能有著重要的意義，我們既往的研究表明[12]，hESGc上有HGF特異性受體c-Met表達，含40～80ng/ml的HGF的培養基能明顯促進hESGc的增殖，20～40ng/ml HGF可促進hESGc細胞移行(P<0.05)。下調c-Met對hESGc的生物學行為影響未見報道。

RNA干擾技術具有高效、穩定且易操作等特點，Shinomiya等用腺病毒介導的siRNA技術研究發現下調c-Met表達可抑制多種細胞的體外生長，器官發生和體內成瘤[13]。本研究構建了含siRNA c-Met的腺病毒，感染hESGc后能有效的抑制c-Met的表達，下調70%，能明顯抑制hESGc的增殖，2天抑制率為16.8% 4天抑制率為34.5%(P<0.05)，有統計學差異。

本實驗通過基因轉染和RNA 干擾技術， 將針對c-Met 基因的靶向siRNA轉染入體外培養的hESGc，探討其對細胞c-Met的表達及細胞增殖能力的影響，為汗腺疾病的基因治療和汗腺發生發育研究提供新的思路和理論依據。

[參考文獻]

[1]王有虎，劉毅，哈小琴. 肝細胞生長因子在整形外科領域中的研究進展[J]. 中國美容醫學， 2007，16(8):1155-1157

[2]雷霞， 伍津津， 魯元剛， 等. 人汗腺腺上皮細胞快速分離培養的初步研究[J]. 中華皮膚科雜志， 2006， 39(2): 86-88.

[3]郭樹忠，舒茂國，李立文. RNA干擾技術簡介[J]. 中國美容醫學， 2005，14(2):151-152

[4]Luo JY， Deng ZL， He TC， et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system[J].Nature Protocols，2007， 2(5): 1236-1247

[5]He TC， Zhou SB， Costa L，et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses[J]. Proceed NationAcaSciUSA ，1998， 95:2509-2514

[6]Miura Y， Yanagihara N， Imamura H， et al. Hepatocyte growth factor stimulates proliferation and migration during wound healing of retinal pigment epithelial cells in vitro[J]. Jpn J Ophthalmol， 2003， 47(3):268-275

[7]Ma PC， Maulik G， Christensen J， et al. c-Met: structure， functions and potential for therapeutic inhibition[J]. Cancer Metastasis Rev， 2003， 22(4): 309-325

[8]Kamimoto M， Mizuno S， Matsumoto K， et al. Hepatocyte growth factor prevents multiple organ injuries in endotoxemic mice through a heme oxygenase-1-dependent mechanism[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Mar 6; 380(2): 333-337

[9]Maggiora P ， Gambarotta G， Olivero M ， et al . Control of invasive growth by the HGF receptor family [J] . J Cell Physiol ，1997，173(2):183-186.

[10]Parr C， Hiscox S， Nakamura T， et al . Nk4， a new HGF/ SF variant， is an antagonist to the influence of HGF/ SF on the motility and invasion of colon cancer cells[J] . Int J Cancer，2000，85(4):563-570.

[11]胡麗婷，趙桂秋，杜兆東，等. 針對c-Met基因的RNA干擾對晶狀體上皮細胞增殖的影響[J] .中國康復理論與實踐，2008 ，14(5) :442- 444.

[12]雷 霞，伍津津，魯元剛，等.肝細胞生長因子對人外泌汗腺上皮細胞促增殖作用的研究[J].中國修復重建外科雜志，2008，22(5): 614-618.

[13] Shinomiya N， Gao C F， Xie Q， et al. RNA interference reveals that ligand-independent metactivity is required for tumor cell signaling and surviva [J]. CancerRes， 2004， 64(21): 7962-7970.

[收稿日期]2010-06-20[修回日期]2010-08-18

編輯/張惠娟