熊果苷對A375細胞與HACAT共培養模型中黑素合成的影響

[摘要]目的:體外構建研究色素問題的黑素瘤細胞(A375)與角質形成細胞(HACAT)直接接觸的共培養模型，利用熊果苷對此共培養體系進行驗證。方法:MEM培養基分別培養A375細胞與HACAT細胞，A375細胞與HACAT以1:2的比例共培養，構建黑素瘤細胞與角質形成細胞直接接觸的共培養模型;將不同濃度熊果苷作用于此模型，用MTT法、多巴氧化法及NaOH裂解法檢測熊果苷對細胞增殖、酪氨酸酶活性以及黑素合成的影響。結果:A375細胞與HACAT能共同存活，1.0mg/ml、0.5mg/ml和0.2mg/ml熊果苷對共培養細胞的增殖、黑素細胞酪氨酸酶活性及黑素合成均有較強的劑量相關的抑制作用，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。結論:成功構建了A375細胞與HACAT細胞直接接觸的共培養模型;脫色藥熊果苷作用于本模型后引起酪氨酸酶及黑素的變化與預期結果一致;本模型為進一步研究色素問題奠定了基礎。

[關鍵詞]共培養模型;黑素瘤細胞;角質形成細胞;熊果苷

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)09-1321-03

Effect of Arbutin on the in vitro model of the Melanoma Cells and keratinocyte co-culture system

WANG Xing-yan，WANG Tian-ye，CHEN Qiao-yun，ZHANG Ning，LI Shao-min，CHEN Jing-hua

(Department of Cosmetology of TCM，Jiamusi College，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China)

Abstract:ObjectiveTo Establish the in vitro co-culture model of melanoma cells and keratinocytes，and observe the effect of Arbutin on pigmentation in co-culture model of melanoma cells and keratinocytes.MethodsWe cultivated the melanoma cells and keratinocytes respectively and then constructed the mixed cultivating model of them.After arbutin was added to the model，celludar proliferation，tyrosinase activity and melanin content were measured by MTT assay，L-DOPA oxidation assay and NaOH assay respectively.ResultsThe in vitro co-culture model of melanoma cells and keratinocytes was established successfully The proliferation of co-culture cells，tyrosinase activity and the melanin synthesis were markedly suppressed by arbutin in a dose-dependent manner.The significant suppression was observed with 1.0mg/ml，0.5mg/ml，0.2mg/ml of arbutin than that with control.ConclusionWe have successfully constructed the co-culture model of melanoma cells and keratinocytes， Arbutin known to inhibit melanogenesis were examined using the co-culture model and the results were consistent with expectations. This model provide requirement for further study.

Key words:co-culture model;melanoma cells;keratinocytes;Arbutin

黑素是決定皮膚顏色的最主要因素，在黑素細胞的特征性細胞器-黑素小體中合成。生理情況下一個黑素細胞與周圍約36個角質形成細胞相接觸，構成表皮黑素單位[1]，黑素代謝是一個發生于黑素細胞(MC)與角質形成細胞(KC)之間并主要由角質形成細胞及其分泌的細胞因子調控的完整的過程。自1982年Eisinger和Marko[2]體外培養皮膚MC成功以來，黑素細胞體外培養技術已被廣泛應用于基礎及臨床研究中，包括退色素藥物的篩選、機理、療效及毒性的研究。然而這種黑素細胞的單獨培養未考慮體內其它鄰近細胞對黑素細胞的影響。1988年Halaban[3]首次成功地建立了體外模擬“表皮黑素單元”的黑素細胞和角質形成細胞共培養模型，使研究者得以使用更接近皮膚生理學特點的模型來開展一系列研究。研究結果[4-6]表明KC-MC共培養體系下針對影響黑素代謝藥物篩選的結果不同于單獨培養黑素細胞基礎上的篩選結果。本實驗構建了KC-MC共養模型，模擬體內“表皮黑素單元”結構，用公認的脫色藥熊果苷作用于本模型，觀察本模型對熊果苷作用的反應是否與預期一致，驗證本模型能否用于脫色素藥物的篩選及機理研究。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人黑素瘤細胞株(A375)由中國科學院細胞中心提供;人永生化角質形成細胞(HACAT細胞)購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。

1.1.2試劑與儀器:MEM培養基(Gibco公司);胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、雙抗(Billab公司);二甲基亞砜、甲基噻唑四唑、L-dopa、TritonX-100、熊果苷(購于Sigma公司);磷酸緩沖鹽(北京中杉金橋有限公司)。離心機(上海安亭科學儀器廠);酶標儀(上海熱電儀器有限公司);Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus株式會社);生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);小容量恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器有公司);超低溫冰箱(Thermo Electron Corporation);CO2孵育箱(上海智成分析儀器制造有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1黑素瘤細胞與角質形成細胞混合培養模型的建立:常規培養A375細胞及HACAT細胞。取對數期生長狀態良好的A375細胞及HACAT細胞消化、離心、MEM培養液重懸細胞后計數，按A375細胞與HACAT細胞比例為1:2將兩種細胞懸液混合。每次實驗的細胞取自同一原瓶。

1.2.2分組及給藥:實驗分給藥組、陰性對照組和空白組。給藥組熊果苷的濃度分別0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/ml;陰性對照組直接加培養基;空白組不加細胞，只加培養基。以空白孔調零，各組設6個復孔。

1.2.2細胞增殖活性測定:將混合后的細胞用含10%FBS和1%雙抗的MEM培養基調整細胞濃度為1.5×104個/ml，按每孔200μl接種至96孔板，5%CO2，37℃培養箱培養8～12h。細胞貼壁后換含不同濃度熊果苷的培養液，繼續培養48h。培養結束前4h加5mg/ml的MTT 20μl，繼續培養4h后，倒扣法去除培養液，每孔加入150μl DMSO，將培養板置于微孔板震蕩器震蕩10min，使結晶溶解。酶標儀490nm測定吸光度值。細胞增殖活性用A490值表示。

1.2.3 酪氨酸酶活性測定:將混合后細胞濃度調整為1.5×104個/ml，按每孔200μl接種至96孔板培養24h后棄培養基，換含不同濃度熊果苷的培養液，繼續培養48h。用pH7.4的0.01M的PBS洗滌2次，每孔加1%Triton-X溶液100μl，迅速置-80℃冰箱內放置30min后，之后室溫下融化，充分裂解細胞。37℃預熱，加入0.5%L-DOPA溶液50μl/孔，于37℃下反應3h，以490nm波長測定各孔OD值，每個濃度設6個復孔，每一處理因素重復3次。酪氨酸酶活性用A490值表示。

1.2.4 黑素含量的測定:采用Hunt[7]法測定黑素量。共培養細胞以4.5×104/ml，接種6孔板，每孔2ml(約90 000個細胞)，置于培養箱中培養24h后，給藥組用含不同濃度熊果苷的新鮮培養液換液1次，對照組只加培養基;繼續培養48h后，吸棄培養液，加入0.25%胰酶0.5ml/孔消化后，加入1mlMEM中止消化，制成細胞懸液，將細胞懸液收集到10ml離心管中，1 500r/min離心5min，棄去上清液，然后加入100μl濃度為1mol/L NaOH，37℃水浴lh，充分裂解細胞和溶解黑素顆粒。加入400μl雙蒸水釋稀，充分混勻后，100μl/孔分別加至96孔板，置酶標儀測OD值，波長為490nm。每一處理因素重復3次。黑素含量用A490值表示。

1.3 統計分析:所測數據采用SPSS16.0統計軟件包進行統計，各處理組與對照組多重比較用方差分析。

2結果

2.1 黑素瘤細胞與角質形成細胞混合培養:Hacat細胞與A375細胞可共同存活，A375細胞呈梭形、雙極、三極或多分支樹突狀。Hacat細胞呈近似菱形，簇集成團。如圖1。

2.2 熊果苷對共培養細胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量的影響:見表1。

由表1可見，熊果苷濃度≥0.2mg/ml時，對共培養細胞的增殖有顯著抑制作用，與陰性對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01);熊果苷濃度≤0.1mg/ml時，對共培養細胞增值無明顯影響。熊果苷對共培養模型中酪氨酸酶活性呈劑量依賴性抑制。熊果苷濃度≥0.2mg/ml時，對共培養細胞中酪氨酸酶活性有顯著抑制作用，與陰性對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01);熊果苷濃度≤0.1mg/ml時，對共培養細胞中酪氨酸酶活性無明顯影響。熊果苷對共培養模型中黑素合成呈劑量依賴性抑制。熊果苷濃度≥0.2mg/ml時，對共培養細胞中黑素合成有顯著抑制作用，與陰性對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01);熊果苷濃度≤0.1mg/ml時，對共培養細胞黑素合成無明顯影響。

3討論

脫色藥熊果苷對單獨培養的人黑素瘤細胞株(A375)黑素合成的抑制作用已得到證明[8]，而本實驗用A375細胞與人永生化角質形成細胞(HACAT)混合培養模型，將公認的脫色藥熊果苷以不同濃度作用于此模型發現:A375與HACAT在混合培養時可共同存活;脫色藥熊果苷作用于此模型可劑量依賴性抑制抑制酪氨酸酶活性和黑素合成。本研究結果與解士海[9]利用正常人表皮黑素細胞與角質形成細胞共培養模型研究熊果苷美白機理所得結果相似。李杰等[10]利用該模型研究了中藥方“白消一號”治療白癜風的機理發現白消一號能促進黑素瘤細胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成。結合上述兩位研究者的結果說明本模型能反映脫色藥物對黑素代謝的影響，可用于脫色素藥物的篩選及其作用機理的研究。本模型中所用細胞能無限傳代細胞，較原代培養的正常人角質形成細胞和黑素細胞容易獲得和培養。本實驗結果顯示熊果苷抑制黑素合成的濃度與其抑制黑素細胞的增殖的濃度基本一致，說明其美白作用主要與其細胞毒性有關，與宋琦如[11]的研究結果相同。但0.5mg/ml及0.2mg/ml熊果苷對共培養細胞增殖的抑制程度低于對黑素合成抑制程度(與相應對照組比分別為P<0.05，P<0.01)，0.5mg/ml熊果苷對共培養細胞增殖的抑制程度小于其對酪氨酸酶的抑制程度(與相應對照組比分別為P<0.05，P<0.01)，說明脫色藥熊果苷的美白機理還與其抑制酪氨酸酶活性和(或)影響黑素合成的其它環節有關。

[參考文獻]

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[8]劉邦民，張涓，陶春蓉，等. 驗方祛斑湯對A375人黑素瘤細胞黑素合成的影響[J]. 時珍國醫國藥，2009，20(1):210.

[9]解士海.表皮黑素細胞-角質形成細胞共培養及11種化合物對黑素沉著的影響研究[D].北京:中國協和醫科大學博士畢業論文，2006.

[10] 李杰，顧軍，畢新嶺，等.白消一號方對黑素瘤細胞與角質形成細胞混合培養模型中黑素合成的影響[J].中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2009，8(3):139-141.

[11]宋琦如，李吳萍，沈光祖，等.熊果苷對皮膚黑素細胞的生物學效應[J].寧夏醫學院學報，2004，26(5):313-316.

[收稿日期]2010-06-17[修回日期]2010-08-18

編輯/張惠娟