細胞共培養技術在美白藥物研究中的應用及前景

隨著生活水平的提高，人們對生活質量的要求越來越高，越來越重視皮膚的自然美白。運用細胞培養技術從中藥中尋找安全、有效的脫色劑已成為研究的主要方向[1-2]。目前，所用的細胞實驗模型有一種細胞的單獨培養、兩種或兩種以上細胞的共培養。單獨培養一種細胞未考慮體內其他細胞對其產生的作用，而細胞共培養彌補了這方面的不足，讓研究者能夠使用更符合生理學特點的模型來進行一系列研究[3-5]。本文就細胞共培養技術篩選美白藥物的發展現狀及前景綜述如下。

1細胞共培養的方法

細胞共培養技術目前應用的方法可分為單層混合共培養技術、非接觸式共培養技術和組織工程支架技術。單層共培養是將兩種以上細胞放入同一器皿中共同培養的方法，非接觸式共培養是通過Transwell小室來實現的。將Transwell小室放入培養板中，小室內稱上室，培養板內稱下室，上下室以聚碳酸酯膜相隔，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。組織工程支架技術是將在體外培養、擴增的正常組織細胞種植到具有良好生物相容性且在體內可逐步降解吸收的組織工程多孔支架上，使細胞在支架上增殖、分化[6]。現階段美白藥物篩選常用的是單層混合共培養技術，非接觸式共培養還未見用于美白藥物篩選，而組織工程支架技術中的皮膚類似物將可能成為發展方向。

2細胞共培養技術在美白藥物篩選領域的應用及發展

黑素合成和轉運的每一個過程都有著精細的調控機制，其中任何一個環節出現結構和功能的異常，都有可能引起皮膚色素異常性改變[7-9]。黑素生成是發生于黑素細胞的細胞器黑素小體，此過程包括黑素小體的形成和在L-酪氨酸酶作用下轉化成為黑素的生化途徑。酪氨酸酶是這一生物合成過程的關鍵酶，其活性與黑素合成量密切相關，控制其活力即可控制黑素生成量。因此，可通過抑制酪氨酸酶活性和黑素生成量來篩選美白藥物，黑素細胞單獨培養或黑素細胞與角質形成細胞共培養將是美白中藥篩選的有效途徑。

大量學者嘗試通過黑素細胞單獨培養來篩選能夠使黑素合成、轉運受阻的美白藥物。楊壯群等[1，10-12]均通過單獨培養黑素細胞篩選出有些中藥提取物可以抑制酪氨酸酶活性、降低黑素含量，表明單獨培養黑素細胞是一種篩選美白藥物行之有效的方法。但隨著對皮膚構造的深入了解，研究者意識到與黑素細胞相連的角質形成細胞對其發揮的作用不容忽視，羅增香等[13]通過中藥單體蛇床子素、黃芩苷對黑素合成的研究發現，共培養體系中藥物對黑素合成的抑制作用強于單獨培養的黑素細胞，說明了兩種培養方法確實存在差別。由于細胞共培養體系更接近正常人皮膚的真實構造，得出的數據更有說服力，所以研究者便把篩選藥物的方法從黑素細胞單獨培養向黑素細胞和角質形成細胞共培養過度，而更接近人體皮膚結構的皮膚類似物也有希望成為美白藥物篩選的新方法。

2.1單層混合共培養的應用:單層混合共培養是將所研究的不同種類的細胞在同一培養器皿中混合培養。它提供了類似體內的復雜微環境，包括細胞與細胞間的接觸反應和細胞因子的作用。由于其操作簡便，目前廣泛應用于模擬人表皮微環境的實驗研究。1988年，Halaban[14]首次成功地將黑素細胞和角質形成細胞共培養，驗證了該模型的可行性。馬慧軍等[15]也成功建立了人表皮原代黑素細胞與角質形成細胞共培養的體外模型，為美白藥物的篩選提供了可行的方法。仲少敏等[16]選取85種生藥醇提物和水提物在 melan-a 與SP-1 共培養體系做實驗研究，熊果苷作為陽性對照，結果川芎、威靈仙、桂枝、麥冬、白果、蒿本、紅花、白蘇葉的醇提物，五倍子的水提物在細胞培養水平對黑素生成有明顯抑制作用，強于相同濃度熊果苷的作用，這一結果可為美白藥物篩選提供依據。蘭海龍等[17]以人包皮組織作為細胞來源，體外構建黑素細胞與角質形成細胞直接接觸的混合培養模型，檢測蘆薈苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后對黑素細胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影響，發現三種單體均對黑素細胞酪氨酸酶活性及黑素合成產生濃度依賴性抑制，初步闡明了美白藥物的作用機理。解士海[4] 通過建立人表皮黑素細胞-角質形成細胞共培養的體外模型，研究了丹皮酚、苦參堿、氧化苦參堿、大黃素等中藥單體對黑素合成過程的影響，結果表明通過觀察黑素小體的轉運證明了共培養模型的成功建立;熊果苷、丹皮酚、苦參堿劑量依賴性抑制共培養體系中黑素小體的轉運;大黃素、氧化苦參堿對于黑素小體的轉運無影響，表明丹皮酚具有很好的美白應用開發前景，大黃素及苦參堿有待進一步研究。左付國[9]建立了人的黑素細胞與角質形成細胞共培養模型，研究了熊果苷和淫羊藿苷兩種中藥單體對黑素小體轉運的影響及其可能的作用機制，發現熊果苷可通過誘導黑素細胞樹突退縮，抑制黑素小體的轉運，這一研究結果為熊果苷作為美白藥物提供了一項新的依據。

2.2皮膚類似物的應用前景:單層混合共培養模型可以對美白藥物進行有效的篩選，但Tae-Jin Yoon 等[18]通過實驗證明了黑素瘤細胞或黑素細胞單獨培養或是與角質形成細胞共培養得到的數據與三維皮膚類似物的均有不同，而皮膚類似物更能準確地表現組織學構造，所以皮膚類似物模型，有望用于中藥美白藥物的大范圍篩選，提高工作效率。人類正常皮膚主要以Ⅰ型和Ⅲ型膠原為主，其中Ⅰ型膠原含量最多，由于膠原分子結構中含有大量的雙羧基及雙氨基氨基酸和碳水化合物，適于細胞的粘附;膠原又是一種廣泛存在于動物皮膚、肌腱和其他結締組織中的天然蛋白質，來源廣泛。因此，在膠原重組膜上接種人黑素細胞和角質形成細胞可以建立皮膚類似物模型。Lee等[19]利用含角質形成細胞和黑素細胞的皮膚類似物模型檢測化合物光毒性，結果顯示光生物學效應與天然皮膚很接近;Damour等[20]很早便指出組織工程皮膚將成為評估化妝品原料及產品皮膚刺激、光毒性、光保護等特征的有用工具，這都為皮膚類似物模型成為篩選美白中藥的有效途徑提供了依據。楊穎颙等[21-22]分別從胎牛皮和大鼠鼠尾腱中提取膠原纖維，再經處理制成生物相容性良好的膠原作為支架，在支架材料上種植成纖維細胞構建皮膚類似物模型。楊壯群等[23-24]通過人永生化表皮細胞(HaCaT)和黑素細胞共培養體系接種在鼠尾膠原凝膠支架上構建皮膚類似物模型。張鐵良等[25]將鼠尾膠原溶液、濃縮培養基、NaOH溶液和以血清重懸的成纖維細胞溶液在適當的比例下混合后形成凝膠構建真皮類似物。劉源等[26]也運用組織工程方法以包皮組織作為細胞來源構建含有黑素細胞的皮膚類似物模型。雖然以上皮膚類似物模型的建立多是用于研究皮膚缺損的修復，美白中藥篩選還未有人使用這種模型，但由于皮膚類似物模型有可能與人皮膚組織融合，將使得中藥美白藥物篩選的數據更加可靠，篩選方法更加有效，可以作為美白藥物篩選的新嘗試。

3小結

現今，通過細胞共培養技術篩選美白藥物已成為研究的熱點。細胞共培養技術經歷了單層細胞的接觸、非接觸式共培養到三維皮膚類似物，共培養方法已日趨成熟。單層細胞共培養由于操作簡單適合于實驗室中藥物篩選的研究，而且該模型接近真實的人體生理環境，使研究者能夠更好地觀察細胞與細胞、細胞與培養環境之間的相互作用以及探討藥物的作用機制和可能作用的靶點，填補了一種細胞單獨培養和整體動物實驗的空白[27]，用此方法已篩選出了許多有效的中藥提取物，有些已用于美白產品中。而三維皮膚類似物模型由于已驗證了它與人類缺損皮膚的融合能力，證明了它與正常人皮膚具有良好的相似度，用該模型進行藥物篩選得到的結果將更具有可信度。如果能夠商品化皮膚類似物，將為中藥美白藥物的篩選提供一個更方便、快捷、有效的途徑[28]。共培養技術的不斷發展給研究者帶來了新的機遇與挑戰，在研究者的共同努力下將會得到更加方便、有效的藥物篩選方法。

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[收稿日期]2010-07-19 [修回日期]2010-08-31

編輯/李陽利