ADSC-bFGF對大鼠腹壁成形術(shù)后TRAM皮瓣活性的影響

[摘要]目的:研究脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子(ADSC-bFGF)對大鼠腹壁成形術(shù)后腹部橫行腹直肌肌皮瓣(TRAM flap)活性的影響。方法:體外分離、培養(yǎng)、鑒定SD大鼠ADSC。建立大鼠腹壁成形術(shù)模型。分別給予A組(ADSC-bFGF)、B組(ADSC)、C組(纖維蛋白凝膠)及D組(生理鹽水)。所有動物腹壁成形術(shù)后一個月建立TRAM皮瓣模型。術(shù)后7天測定皮瓣成活面積、組織學(xué)觀察和微血管密度(MVD)。結(jié)果:A、B、C、D四組的皮瓣存活率分別為(69.40±2.81)%、(66.19±2.32)%、(46.69±2.41)%和(43.77±3.55)%;A、B、C、D四組的毛細(xì)血管密度(根/mm2)分別為:(65.30±2.19)根/mm2;(59.99±2.41)根/mm2;(44.71±2.21)根/mm2;(42.44±3.22)根/mm2。皮瓣成活率A組與B組差異有意義(P<0.05 )，且這兩組明顯高于C組及D組，差異有顯著性意義(P<0.01)。微血管密度A組與B組差異有顯著性意義(P<0.01)，且這兩組明顯高于C組及D組，差異有顯著性意義(P<0.01)。免疫組化顯示實驗組中有大量褐色抗原抗體復(fù)合物沉積在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)。結(jié)論:ADSC-bFGF能刺激大鼠腹部橫行腹直肌肌皮瓣的血管新生和增加血管數(shù)量，從而增加皮瓣的存活率。

[關(guān)鍵詞]脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞;堿性成纖維細(xì)胞生長因子;腹壁成形術(shù)橫行腹直肌肌皮瓣

[中圖分類號]R622[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)09-1309-04

Effect of ADSC with bFGF growth factor after abdominoplasty on TRAM flap viability in a rat model

PI Gang，YANG Da-ping，LIU Guo-feng

(Department of Plastic Surgery，the Second AffiliatedHospital，Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China)

Abstract:ObjectiveTo establish the effect of ADSC with BFGF on the survival of rat TRAM Flap Mode after Abdominoplasty.MethodsADSC were isolated from SD rat and cultured in vitro.A abdominoplasty Mode was constructed in all animals. Group A (ADSC-bFGF) received intramuscular injection of ADSC with bFGF during abdominoplasty. Animals from groups B (ADSC) and C (fibrin plasmagel) underwent abdominoplasty and were injected intramuscularly with physiologic saline solution， respectively. The TRAM flap was created 30 days after abdominoplasty in all animals. The viable area of the flap was calculated with Adobe Photoshop CS2 software on the day 7 after operation. The microvessel density (MVD) of the flap was counted.ResultsThe mean viable proportion of flaps was 69.40±2.81 percent in group A，There was difference between group A and group B(66.19±2.32 percent)in terms of mean viable flap area(P﹤0. 05)，Comparing the mean viable area of the flap 46.69±2.41 percent in group C and 43.77±3.55 percent in group D，the difference was significant(P﹤0.01).For MVD，flap in group A (65.30±2.19) was significantly different with group B (59.99±2.41) (P﹤0. 01)，and both of these two groups were significantly higher than group C (44.71±2.21)and group D(42.44±3.22) (P﹤0. 01).Immunohistochemical staining documented the increased deposition of antigen antibody complex the plasma of endothelial cells of the flap.ConclusionADCs with bFGF can increase ischemic flaps neovascularization and augment the survival areas.

Key words:adipose derived stromal cell;basic fibroblast growth factor;abdominoplasty;transverse rectus abdominalis musculocutaneous flap(TRAM flap)

皮瓣移植是修復(fù)皮膚缺損創(chuàng)面的主要手段，而皮瓣缺血性壞死則是臨床上最常見的并發(fā)癥。采用單蒂腹部橫行腹直肌肌皮瓣(Transverse rectus abdominalis musculocut aneous flap，TRAM flap)進(jìn)行乳房再造是目前常用的乳房再造方法[1]，其缺點是手術(shù)對腹直肌及前鞘的損傷，術(shù)后容易出現(xiàn)腹壁不對稱、腹壁薄弱、腹壁疝和皮瓣壞死等并發(fā)癥[2]。 該術(shù)式皮瓣血供減少，皮瓣部分壞死概率增加。尤其是在做過腹壁成形術(shù)和術(shù)中破壞了穿支血管的患者。其原因主要為動脈供血不足和/或靜脈回流不暢，因此如何改善微循環(huán)一直是整形顯微外科研究領(lǐng)域的重要課題。本研究的目的是使用脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子(ADSC-bFGF)刺激腹部橫行腹直肌肌皮瓣(TRAM flap)的血管新生，從而增加皮瓣的存活率。

1材料

1.1 設(shè)計:采取隨機(jī)，對照，動物實驗。

1.2 時間及地點:于2010-04至2010-07在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗室完成。

1.3 實驗材料:健康純種成年雄性SD大鼠，質(zhì)量為250～280g(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，共28只。DMEM-F12培養(yǎng)基(美國Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青公司，中國)，CD31單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，PV-6000通用型二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，纖維蛋白凝膠(上海利康瑞生物工程有限公司)，貝復(fù)濟(jì)(珠海億勝生物制藥有限公司)。

2方法

2.1 脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose derived stromal cell ，ADSC)的體外分離、純化、擴(kuò)增培養(yǎng):取250～280g的雄性SD大鼠，無菌條件下采集雙側(cè)腹股溝脂肪墊，剪碎脂肪。0.075%Ⅰ型膠原酶消化1h，用含血清的DMEM-F12培養(yǎng)液終止消化，1500 r/min，離心10min，用含有10%胎牛血清的DMEM重懸。按3×105/cm2的細(xì)胞密度接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%C02飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。72 h更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每3天換液1次。通過反復(fù)傳代可得到純化的ADSC(圖1)。

2.2 實驗分組及治療:實驗動物隨機(jī)分為4組，每組7只。①A組:腹壁成形術(shù)后制作TRAM皮瓣組(ADSC+ bFGF);②B組:腹壁成形術(shù)后制作TRAM皮瓣組(ADSC);③C組:腹壁成形術(shù)后制作TRAM皮瓣組(纖維蛋白凝膠);④D組:腹壁成形術(shù)后制作TRAM皮瓣組(生理鹽水)

2.3 動物模型構(gòu)建

2.3.1 腹壁成形術(shù)模型及治療:健康純種成年雄性SD大鼠，250～280g。水合氯醛(10%)腹腔注射麻醉(0.3ml/100g)，麻醉完畢，將SD大鼠采取仰臥位固定在大鼠板上。

腹壁成形術(shù)的切口設(shè)計線呈倒梯形狀。先描畫出劍突的位置，在鼠尾方向離劍突1cm的位置設(shè)計出與腹正中線垂直的5cm上底線。向下0.5cm再設(shè)計出與該線平行的水平線。尾部方向的基底線長2cm，距上底線3cm(圖2A)。0.5%碘伏消毒大鼠腹部術(shù)區(qū)，鋪無菌洞巾。沿切口線切開大鼠皮膚、皮下至深筋膜層，沿頭尾方向在深筋膜層掀起皮瓣，離斷進(jìn)入皮膚的穿支。標(biāo)出兩側(cè)腹直肌腱膜，其大小為3cm×0.5cm，距腹正中線0.25cm。對A、B、C、D四組分別用ADSC-bFGF懸液(細(xì)胞為第四代)、ADSC細(xì)胞懸液(第四代)、纖維蛋白凝膠和生理鹽水，分四點注射到腹直肌上(圖2B)。每點均為0.1ml，總量為0.4ml/只。然后將0.5cm×5cm的皮條切除。縫合切口。實驗完畢后單籠飼養(yǎng)，麻醉清醒后，自由供應(yīng)飲食飲水。每日觀察大鼠的生活狀態(tài)。

2.3.2 TRAM模型建立:腹壁成形術(shù)后1個月，所有實驗動物均構(gòu)建TRAM模型。

TRAM皮瓣位于劍突下1cm，大小為10.5cm2。沿設(shè)計線切開皮膚后，將皮瓣從左側(cè)的蒂部向腹白線分離。將右側(cè)的皮瓣從外側(cè)緣向腹直肌分離。沿腹白線和腹直肌外測沿作縱切口，將頭側(cè)的腹直肌切斷，制作成以右側(cè)腹直肌為蒂，腹壁下動脈供血的皮瓣(圖3)。

2.4 皮瓣壞死的鑒定:在TRAM皮瓣術(shù)后7天進(jìn)行皮瓣壞死面積的評估(圖4)。術(shù)后7天水合氯醛10ml/kg腹腔注射處死動物。即刻切取全部腹壁組織(包括腹直肌)，用硫酸紙描繪皮瓣成活區(qū)域范圍并掃描入計算機(jī)。應(yīng)用Adobe Photoshop CS2軟件測量皮瓣成活面積，以成活面積/設(shè)計面積的比值表示皮瓣成活情況。

2.5 組織標(biāo)本取材:根據(jù)Lineaweaver等[3]的方法，將TRAM皮瓣分為四個區(qū):Ⅰ區(qū)，腹中線到右側(cè)腹直肌外側(cè)緣間的區(qū)域;Ⅱ區(qū)，腹中線到左側(cè)腹直肌外側(cè)緣間的區(qū)域;Ⅲ區(qū)，右側(cè)腹直肌外側(cè)緣到右側(cè)皮瓣邊緣的區(qū)域;Ⅳ區(qū)，左側(cè)腹直肌外側(cè)緣到左側(cè)皮瓣邊緣的區(qū)域。無菌條件下切取大鼠皮瓣小塊約0.5cm×0.5cm大小組織，分別取距皮瓣各區(qū)中間的組織。用4%甲醛固定24h后制成石蠟病理切片;一部分切片用于蘇木素-伊紅染色，觀察組織病變情況;另一部分則用于免疫組化檢測。

2.6 微血管密度(microvessel density，MVD)檢測:標(biāo)本石蠟切片后HE染色，40倍光學(xué)顯微鏡在皮下組織中隨機(jī)取6個視野計算微血管數(shù)取平均值，根據(jù)每個視野0.1885mm2換算成每mm2血管數(shù)做統(tǒng)計學(xué)處理。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理:用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用各組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，各組間比較采用t檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 皮瓣活性:皮瓣模型建立1周后，觀察大鼠腹部皮瓣。大鼠皮瓣Ⅰ區(qū)的全部、II區(qū)及Ⅲ區(qū)的小部份存活。A組基本存活，創(chuàng)面干燥。而其他三組存在不同程度的壞死現(xiàn)象。圖片經(jīng)圖像分析系統(tǒng)計算出A，B，C，D四組的存活面積百分比分別是(69.40±2.81 )%、(66.19±2.32)%、(46.69±2.41) %和(43.77±3.55)%。統(tǒng)計學(xué)分析皮瓣成活率A組與B組差異有意義(P<0.05 )，且這兩組明顯高于C組及D組，差異有顯著性意義(P<0.01)。C組與D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1，2)。

3.2 HE染色分析:術(shù)后第7天，切取的皮瓣組織病理切片，HE染色可見，A、B兩組表皮完整有輕度萎縮，組織內(nèi)輕度炎癥浸潤，有較高密度的小血管分布，內(nèi)有紅細(xì)胞充盈，纖維組織細(xì)胞增生明顯。C、D兩組皮瓣萎縮明顯，皮下組織有水腫，炎細(xì)胞浸潤明顯，新生血管數(shù)目較少，皮下纖維增生，排列不規(guī)則 (圖5)。

3.3 微血管密度(MVD)測量:各組動物術(shù)后第7天皮瓣內(nèi)MVD:(65.30±2.19)根/mm2;(59.99±2.41)根/mm2;(44.71±2.21)根/mm2;(42.44±3.22)根/mm2。皮瓣微血管密度A組與B組差異有顯著性意義(P<0.01);A、B兩組明顯高于C組(P<0.01)及D組(P<0.01)，差異有顯著性意義;C組與D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3、4)。

3.4 免疫組化結(jié)果:注射ADSC-bFGF組組織內(nèi)血管內(nèi)皮CD31呈陽性表達(dá)，染色的血管內(nèi)皮標(biāo)記出微血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞漿內(nèi)褐色抗原抗體復(fù)合物沉積，甚至可見抗原抗體復(fù)合物呈帶狀圍繞血管腔，而生理鹽水組不明顯(圖6)。

4討論

大鼠腹部血管結(jié)構(gòu)同人體相似，大鼠TRAM皮瓣模型已證實是可靠的實驗動物模型。我們采用了de Freitas等[4]提出的腹壁成形術(shù)后TRAM皮瓣模型，選擇以腹壁下動脈為供應(yīng)血管，右側(cè)低位帶蒂的TRAM皮瓣。盡管其在大鼠上并不是最理想的動物模型，但它更貼近于人的TRAM皮瓣。血管蒂的肌皮穿支范圍僅限于Ⅰ區(qū)。結(jié)果模型組中Ⅰ區(qū)的全部、II區(qū)及Ⅲ區(qū)的小部份成活，皮瓣Ⅳ區(qū)的全部、II及Ⅲ區(qū)大部份壞死。所有這這些動物模型的皮瓣成活區(qū)域[(4.49±0.44)cm2]及成活率[(42.79 ±1.61)%]比較恒定。具有較好的重復(fù)性。因此以腹壁下動脈為蒂的大鼠腹壁成形術(shù)后TRAM皮瓣模型是一個比較穩(wěn)定和成功的缺血皮瓣動物模型。

目前，基因療法被認(rèn)為是促進(jìn)腹壁成形術(shù)后TRAM皮瓣存活的理想療法。其研究主要集中在應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促進(jìn)微血管生成，但VEGF也是腫瘤血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，在多種惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中起著極為重要的作用，而且再造乳房又在乳腺癌的術(shù)野之中[5]。因此，將VEGF用于乳腺癌術(shù)后乳房再造的患者以促進(jìn)再造乳房皮瓣成活有促進(jìn)腫瘤生長的風(fēng)險，是不合適的，需要尋找新的促進(jìn)皮瓣血供和修復(fù)的手段。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF) 是一種多功能細(xì)胞生長因子，是成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的高效促生長劑，能夠強(qiáng)烈促進(jìn)新生毛細(xì)血管的形成[6-7]。劉斌[8]等對大鼠背部隨意皮瓣應(yīng)用bFGF后，發(fā)現(xiàn)新生微血管的數(shù)量增加，皮瓣成活面積增大。Wong等[9]研究在大鼠腹直肌肌皮瓣術(shù)后bFGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)bFGF能促進(jìn)血管增生，使大鼠皮瓣存活面積顯著增加。

ADSC容易獲得和培養(yǎng)，具有多向分化潛能，在體外容易擴(kuò)增和長期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點在創(chuàng)傷修復(fù)、組織缺血的血管生成和組織工程方面起了非常重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)ADSC移植能促進(jìn)大鼠腦缺血缺血區(qū)微血管的生成，其機(jī)制可能與促進(jìn)bFGF和VEGF的表達(dá)有關(guān)[10]。Moon等評估了ADSC對裸鼠后肢局部缺血模型新生血管形成和血流的影響，發(fā)現(xiàn)實驗組血流指數(shù)和血管密度均顯著高于對照組[11]。

本實驗通過VEGF復(fù)合體外培養(yǎng)的SD大鼠ADSC，利用基因治療和細(xì)胞治療的協(xié)同作用，在建立腹壁成形術(shù)時注射ADSC-bFGF，以期在建立TRAM皮瓣時新生血管的數(shù)量能達(dá)一定水平。注射后第37天(術(shù)后第7天)證實基因和細(xì)胞協(xié)同治療能有效地增加皮瓣成活面積及微血管密度。我們的研究已經(jīng)初步表明，ADSC-bFGF具有更強(qiáng)大的促進(jìn)缺血組織血管新生作用，能有效的增加腹壁成形術(shù)后TRAM皮瓣的成活面積。因此，聯(lián)合治療可作為治療腹壁成形術(shù)后TRAM皮瓣缺血的首選。但是要將ADSC-bFGF治療缺血皮瓣的方法真正應(yīng)用于臨床，尚需大量的工作:①bFGF對ADSC的生物效應(yīng)研究;②ADSC-bFGF促進(jìn)皮瓣血管的具體機(jī)制研究;③治療的穩(wěn)定性、可控性及安全性等。這些將是我們以后進(jìn)一步開展的課題。

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[收稿日期]2010-06-16 [修回日期]2010-08-10

編輯/張惠娟