CD4+CD25+\\CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+ T淋巴細胞的晝夜節律性變化

【摘要】目的:探討CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞的晝夜節律性變化情況。方法:10名健康男性志愿者，年齡24～30歲，平均25歲。預先在晝夜節律模式條件(16h-light:8h-dark cycle，LD)下生活1周:室溫25±1ordm;C，起床時間:7:00，睡眠時間(無光照期):23:00～7:00，早餐時間:7:30～8:00，午餐時間:11:30～12:00，晚餐時間:5:00～6:00;睡眠時光照強度<0.1 Lux;受試者自由飲水，無煙酒嗜好，日常活動和飲食成分基本一致。隨后在一晝夜內每隔4h抽取各受試者外周血3ml，用流式細胞儀測定CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞占CD4+T細胞的百分比，通過余弦法和Clock Lab軟件獲取節律參數，并經振幅檢驗分析是否存在晝夜節律。結果:在自然光制下，CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞的相對數量均呈現晝高夜低的節律性振蕩(P<0.05)，但各細胞相對數量變化的峰谷時點略有不同。結論:人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞的變化均存在著晝夜節律性特征。

【關鍵詞】CD4;CD25;CD69;HLA-DR;晝夜節律;T細胞

【中圖分類號】R331.1+44【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)16-074-2

晝夜節律生物鐘是一種普遍的生物活動現象。哺乳類動物的生物鐘已被定位于下丘腦前部的視交叉上核(suprachias

-matic nucleus，SCN)和松果體[1]。近年的研究發現，免疫系統的組成和功能，如免疫細胞數量、免疫球蛋白的濃度、免疫應答和免疫調節等都存在晝夜節律性變化[2]。CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞是一類已活化的免疫細胞，在免疫應答中起著重要的作用[3]。對于這些活化的T淋巴細胞的晝夜節律性的表達，到目前為止，研究報道并不多。本實驗在模擬自然光制條件下，測定不同晝夜時點外周血中CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞表達的變化，以確定其是否存在晝夜節律特征。

1材料和方法

1.1研究對象與造模

10名健康男性志愿者，年齡24～30歲，平均25歲;既往身體健康，無感染性和自身免疫性疾病，在過去6個月內未做過跨時區旅行和未接受過藥物治療。預先在實驗室晝夜節律模式條件(自然光制，16h-light:8h-darkcycle，LD)下生活1周:室溫25±1ordm;C，起床時間:7:00，睡眠時間(無光照期):23:00～7:00，早餐時間:7:30～8:00，午餐時間:11:30～12:00，晚餐時間:5:00～6:00;睡眠時光照強度<0.1Lux;受試者自由飲水，無煙酒嗜好，日常活動和飲食成分基本一致。

1.2樣品采樣

將外界自然光照起點時間設定為晝夜0時點(自然時間凌晨5時)，把24h自然時點轉換成晝夜時點(zeitgeber time，ZT)。受試者在實驗室生活1周后，在一晝夜內每隔4h按不同晝夜時點(ZT02、06、10、14、18、22，n=6)分別采集其外周靜脈血，每份取樣3ml，每組(每個時點)n=10，肝素抗凝后立即于流式細胞儀檢測三種細胞的百分比。

1.3儀器與試劑

Epics XL#8226;MCL流式細胞分析儀，美國Beckman Coulter公司;CD4單克隆抗體(FITC標記)，CD25單克隆抗體(PE標記)，CD69單克隆抗體(PC5標記)，HLA-DR單克隆抗體(PE標記)，美國Beckman Coulter公司;溶血素(1.5% Formaldehyde)，美國Beckman Coulter公司;PBS緩沖液，自制。

1.4流式細胞分析

取兩根試管，一管加CD4單克隆抗體10μl、CD69單克隆抗體4μl和CD25單克隆抗體10μl到小試管底部，第二管加CD4、HLA-DR單克隆抗體各10μl到小試管底部(不要沾壁)。各吸取50μl肝素抗凝的外周血到小試管中，避免懸液沾到試管壁。充分混勻，室溫下避光放置15min。加入2501μl溶血素，振蕩混勻后置37℃水浴15min。加入2501μlPBS緩沖液振蕩混勻后置37℃水浴15min。加入1mlPBS緩沖液振蕩混勻后1800r/min離心5min，棄上清液，用濾紙吸干管壁，加入250μlPBS緩沖液，振蕩混勻備用。流式細胞儀進行光路質量調控和雙色熒光補償，以前向角FSLIN與側向角SSLIN取淋巴細胞設門，用流式細胞儀分析50000個細胞應用配套分析軟件獲取CD4/CD25、CD4/CD69、CD4/HLA-DR雙陽性細胞占淋巴細胞的百分比。每批測定時，以空白管調整零點。

1.5數據處理

用余弦分析軟件和Clock Lab軟件獲取晝夜節律性參數，并經振幅F檢驗確定靶細胞晝夜節律性表達的變化。用于擬合的余弦函數方程為:F(t)=M+Acos(ωt+Φ)，其中M(mesor)為中值，即漲落變化的中線;A(amplitude)為節律振蕩的振幅，表示向上或向下波動的幅度;Φ(peak phase or acrophase)為峰值相位，是振蕩達到峰值的時刻，可根據ω角速度(360°/24h)將其換算成各ZT時點。數據采用mean±SD表示，組內差異用SPSS17.0 for Windows統計軟件包進行t檢驗;組間差異用相同軟件包進行方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異具有顯著性。

2結果

在LD(16:8)光制下的不同晝夜時點，以CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞百分比作為相對數量變化水平，各細胞的晝夜節律性變化反映于表1;對各晝夜時點變化的數據進行余弦函數分析，發現這三種細胞均具有明顯的晝夜節律性變化(振幅F檢驗，P<0.05)。

表1 在 LD(16:8)光制下，人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+HLA-DR+T細胞各晝夜時點表達的變化

LD(16:8)光制下人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞變化的晝夜節律性參數反映于表2，CD4+CD25+T細胞百分比的峰值和谷值時間分別位于ZT19和ZT7，CD4+CD69+T細胞百分比的峰值和谷值時間分別位于ZT13和ZT1，CD4+HLA-DR+T細胞百分比的峰值和谷值時間分別位于ZT13和ZT1。

表2 在LD(16:8)光制下，人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+HLA-DR+T細胞表達的晝夜節律參數

LD(16:8)光制下，人外周血CD4+CD25+T淋巴細胞晝夜節律性變化的時間外觀趨勢和經余弦函數分析擬合后的余弦曲線呈現于圖1。CD4+CD69+T淋巴細胞晝夜節律性變化的時間外觀趨勢和經余弦函數分析擬合后的余弦曲線呈現于圖2。CD4+HLA-DR+T淋巴細胞晝夜節律性變化的時間外觀趨勢和經余弦函數分析擬合后的余弦曲線呈現于圖3。

圖1CD4+CD25+ T細胞變化的時間外觀趨勢圖(左)，經余弦函數分析擬合后的余弦曲線(右)。

圖2CD4+CD69+ T細胞變化的時間外觀趨勢圖(左)，經余弦函數分析擬合后的余弦曲線(右)。

圖3CD4+HLA-DR+ T細胞變化的時間外觀趨勢圖(左)，經余弦函數分析擬合后的余弦曲線(右)。

3討論

人們很早以來就知道生物體的活動具有節律性，這是生物體為了更好適應環境要求而發生的反應。其中晝夜節律是最為重要的一種生物節律。近年來時間免疫學[4]的研究表明，動物和人的免疫系統也具有多種顯性節律。目前，研究人員對免疫系統的節律性研究較多的是針對免疫器官、免疫細胞和免疫分子的數量和功能。CD25、CD69和HLA-DR是免疫細胞活化時特有的表達分子。活化的淋巴細胞才是淋巴系統的功能細胞，因此，本研究著重從活化的T細胞的節律性變化著手研究，以探討這些活化的T細胞是否同樣具有晝夜節律性的變化。

本實驗中對LD(16:8)光制(即自然光制)條件下，正常成人6個不同晝夜時點采集的外周血標本進行研究，發現自然光制條件下人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞存在著晝夜節律性變化，三種細胞變化的節律振幅、中值和峰值相的水平并不相同，而其節律相位也略有不同。CD4+CD25+T淋巴細胞峰值時間點位于晝夜時點的ZT19，谷值時間點位于ZT7。CD4+CD69+T淋巴細胞和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞峰值時間點均位于晝夜時點的ZT13，谷值時間點均位于ZT1。三種細胞中后兩者峰值時間點均早于前者，這可能是由于三種活化分子(CD25，CD69，HLA-DR)在T淋巴細胞活化時表達的早晚差異造成。

由于外周血淋巴細胞的數量本身存在著節律性的變化[5]，因此本實驗對三種細胞的相對數量進行了研究，避免了因淋巴細胞數量的變化而引起三種細胞絕對數量的改變。雖然研究人員很早就知道中樞核心晝夜節律調控組織主要定位于下丘腦前部的視交叉上核、松果體和視網膜。它通過神經內分泌網絡調控著人體的晝夜節律變化，但隨著對免疫系統晝夜節律研究的深入，我們已經知道，免疫細胞中也存在著一些晝夜節律相關的基因，而且這些基因本身存在著節律性的變化，那么本實驗研究的結果到底是中樞核心晝夜節律調控組織發揮作用還是免疫系統中這些節律性基因在發揮調控作用卻有待于進一步的探討。

參考文獻

[1] Stehle JH，Von Gall C，Korf HW. Melatonin:a clock–output，a clock–input[J]. J Neuroendocrin，2003，15(4):383-389.

[2] 童建.免疫系統的生物節律[J].國外醫學免疫學分冊，1999，22(1):30-33.

[3] Rea IM，Mcnerlan SE，Alexander HD. CD69，CD25 and HLA-DR activation antigen expression on CD3+ lymphocvtes and relationship to serum IFN-alpha，IFN-gamma and SIL-2R levels in aging. Exp Geronto，l999，34:79-93.

[4] Fernandes G，Biological rhythm in clinical and laboratory medicine. springer-Verlang，1992，493.

[5] Smaaland R，Sothern RB，Laerum OD，Abrahamsen JF. Rhythms in human bone marrow and blood cells. Chronobiol Int. 2002 Jan，19(1):101-27.