30例結腸癌患者外周血血管緊張素轉換酶基因多態性檢測

【摘要】目的:研究結腸癌患者外周血血管緊張素轉換酶(ACE)基因多態性分布規律。方法:30例患者為研究組，30例正常人為對照組，采用聚合酶鏈反應(PCR)，對入組的結腸癌患者外周血中ACE基因表達進行檢測，以了解ACE基因插入型(ID型)、缺失型(DD型)和Ⅱ型3種基因型及I/D等位基因在結腸癌患者外周血中的分布規律，并進行統計學處理。結果:結腸癌患者外周血ACE基因插入/缺失(I/D)多態性分布:ID型、DD型和Ⅱ型3種基因型的占比分別為36.67%、6.67%、56.66%，I/D等位基因分布頻率分別為53.30%和46.70%，對照組ID型、DD型和Ⅱ型3種基因型的占比分別為53.33%、16.67%、30.00%，I/D等位基因分布頻率分別為43.33%和56.67%，兩組間基因型分布頻率和I/D等位基因分布頻率均有顯著差異(p<0.05)。結論:結腸癌患者外周血ACE基因多態性中，Ⅱ型基因分布升高和D等位基因分布頻率降低可能與結腸癌發病相關。

【關鍵詞】結腸癌;血管緊張素轉換酶;基因多態性;頻率

【中圖分類號】R735.3+5【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)16-099-2

血管緊張素轉換酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE)是高血壓病和腎病等研究的熱點基因。近年來，結腸癌與ACE基因的關系受到重視，歐洲一項臨床研究顯示，ACE抑制劑(ACEI)能明顯降低結腸癌風險，提示ACE與結腸癌發病可能存在一定關系[1]。有鑒于此，我們開展了本研究，觀察結腸癌患者ACE基因多態性，試圖了解示ACE基因與結腸癌發病之間的關系。

ACE基因位于17號染色體長臂q23位點，長度為21kb，其第16內含子存在一段287bp的DNA序列的插入(insertion，I)或缺失(deletion，D)，構成ACE基因I/D多態性，ACE基因可分出I等位基因和D等位基因，并可劃分出三種基因型:缺失純合子型(DD型)、缺失與插入純合子型(ID型)、插入純合子型(Ⅱ型)[2-3]。對ACE等位基因及基因型的多態性研究有可能揭示兩者之間的關系，從而對ACEI用于結腸癌的治療提供理論依據。迄今，有關ACE基因與結腸癌關系的論著甚少，且結論有相互矛盾的地方，因此，本研究的開展，對于揭示ACE基因多態性與結腸癌發病之間的關系，具有一定的理論意義。

本文檢測30例結腸癌患者外周血中ACE基因DD型、ID型和Ⅱ型3種基因型和I、D等位基因的分布頻率，并與30例正常人外周血ACE基因分布進行比較，現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1病例入選標準共30例，符合下列納入標準和排除標準:①臨床確診結腸癌患者;②所有病例須有病理報告證實;③年齡40-70周歲;排除標準:①不符合結腸癌診斷標準者;②未取得病理報告證實者;③年齡<40歲或>70歲者;④原發性高血壓病患者;⑤合并嚴重心、腦、腎、血液系統疾病患者;⑥精神病患者;⑦不愿意接受本研究措施者。

1.2患者情況年齡40-70周歲，其中男性18例，女性12例，臨床分期Ⅰ-Ⅱ期者17例，Ⅲ-Ⅳ期者13例，結腸腺癌1例，結腸中分化腺癌10例，結腸中低分化腺癌3例，結腸乳頭狀腺癌2例，結腸潰瘍性中分化腺癌2例，結腸粘膜浸潤性腺癌1例，結腸中分化粘液腺癌1例，結腸低分化腺癌2例，結腸管狀腺癌2例，結腸中分化管狀腺癌6例。研究組與對照組除結腸癌外，在一般情況方面比較均無顯著差異(p>0.05)。

1.3DNA提取采用蛋白酶K消化酚-氯仿抽提法。

1.4引物合成和PCR擴增引物由上海生工合成，序列如下:

ACE-Ⅰ-upper:5'-GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT-3'

ACE-Ⅰ-down:5'-GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC-3'

擴增片段大小，插入型為597bp，缺失型為319bp。PCR擴增體系體積為25micro;l，反應體系含Taq酶1.0micro;l，10×buffer2.5micro;l，10mMdNTP0.5micro;l，引物(10pmol/micro;l)各0.5micro;l，模板gDNA約100ng。擴增條件:94℃預變性5分鐘，然后94℃30”，56℃45”，72℃1分鐘，共35個循環;最后72℃5分鐘。試劑均購自Takara公司。對于基因型為缺失型純合子(DD)型的個體再用特異性擴增插入片段的ACE-Ⅱ進行驗證，如擴增出目的片段則為ID型。ACE-Ⅱ引物序列如下:

ACE-Ⅱ-upper:5'-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3'

ACE-Ⅱ-down:5'-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3'

擴增片段大小為335bp，退火溫度為65℃，反應條件同ACE-Ⅰ。

1.5PCR產物檢測PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳約30分鐘，電壓100v，在紫外燈下觀察條帶。Marker為DL2000。

1.6統計學處理采用SPSS12.0統計軟件，組間頻率比較采用X2檢驗，以p<0.05有顯著差異。

2結果

2.1PCR產物電泳結果

各標本取10micro;l產物加樣，電泳，按常規攝片，因:ACEI/D多態性PCR檢測結果。319bp片段(D等位基因)的表達及319bp和579bp片段(I等位基因)的同時表達表示ACE基因的DD，ID和Ⅱ幾種基因型。M:標準對照;4，7，22，25和29:DD純合子;1，3，8，10，11，13，14和17:ID雜合子;2，5，6，9，12和15:Ⅱ純合子。

2.2基因型分析

ACE基因型的分布結果，研究組11例標本為缺失雜合子(ID型)，占比36.67%(11/30);2例標本為缺失純合子(DD型)，占比6.67%(2/30);17例標本為插入純合子(II型)，占比56.66%(17/30);對照組:ID型、D型、II型的占比分別為53.33%、16.67%、30.00%，經統計分析，兩組患者在ID型、DD型、II型基因的分布頻率上有顯著差異(X2=4.410，p<0.05)。

結腸癌患者ACE等位基因檢測結果，結腸癌患者組D和I等位基因的分布頻率分別為43.33%和56.67%，正常對照組分別為70.00%和30.00%，結腸癌患者和正常人外周血ACED和I等位基因存在顯著差異(X2=4.344，p=0.037)。我們還對ACE基因多態性和I/D等位基因進行了亞組分析，由于樣本數量的原因，在性別、病理類型、臨床分期、吸煙史及家族史等因素均未表現出對ACE基因表達的影響。

3討論

血管緊張素轉換酶-Ⅰ(ACE-Ⅰ)在生理情況下通過腎素-血管緊張素系統(RAS)導致血管收縮和血壓升高，并具有影響腫瘤細胞增殖、游走、新生血管生成和遠處轉移等生物學行為[4]。此外，還可能通過在細胞周期中誘導或調節基因表達而發揮致癌因素作用，在體實驗表明AngⅡ受體拮抗劑能有效抑制轉化生長因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)依賴性腫瘤的生長。

Eleftherios氏于2007年報道，ACE基因I/D多態性通過影響ACE基因表達而與口腔癌的發病相關[5]。但ACE基因與結腸癌關系的研究尚無定論，因此本研究具有一定的新意。結果表明結腸癌患者外周血與正常人ID、DD及Ⅱ型基因頻率的分布有顯著性差異，Ⅱ型基因頻率顯著高于對照組(p<0.05)，DD型和ID型顯著低于對照組(p<0.05)，初步證明ACE基因的插入多態性可能為結腸癌發病的重要遺傳因素之一，但與正常人比較，結腸癌患者I/D等位基因分布無顯著性差異，我們的結果初步表明ACE基因多態性可能與結腸癌發病相關。但本研究尚存在一定的不足之處，尚需進行更加深入的基礎與臨床研究。

參考文獻

[1] Christian JB，Lapane KL，Hume AL，et al. Association of ACE inhibitors and angiotensin receptor blockers with keratinocyte cancer prevention in the randomized VATTC trial[J].J Natl Cancer Inst，2008.