臨床血小板應用后血液促凝功能的比較研究

【摘要】目的:比較冰凍血小板和新鮮血小板輸注后血液的促凝功能。方法:該課題以100名志愿患者為研究對象，抽取其新鮮血液2ml后，隨機輸注50份冰凍血小板和50份新鮮血小板懸液，24小時后重新采血。分別經酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測冰凍血小板和新鮮血小板輸注前后的β-血小板球蛋白(β thromboglobulin，β-TG)、血小板α-顆粒膜蛋白-140(granule membrane protein 140，GMP-140)和血小板第4因子(platelet factor 4，PF4)。采用Born氏比濁法檢測冰凍血小板和新鮮血小板輸注前后的聚集率，所用誘導劑的終濃度為花生四烯酸(arachidonic acid，AA)782.0 micro;mol/L、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)47.6micro;mol/L和膠原(collagen)4.8mg/L。結果:冰凍血小板釋放的β-TG、GMP-140和PF4分別為(51.5±4.4)ng/ml、(32.1±6.8)ng/ml和(25.5±4.9)ng/ml，新鮮血小板釋放的β-TG、GMP-140和PF4分別為(40.3±4.0)ng/ml、(24.3±4.8)ng/ml和(18.8±3.6)ng/ml，冰凍血小板釋放的β-TG、GMP-140和PF4均高于新鮮血小板(P<0.05)。在AA、ADP和膠原的誘導下，冰凍血小板的聚集率分別為(81.15±6.39)%、(83.04±6.09)%和(81.25±8.28)%，新鮮血小板的聚集率分別為(76.11±5.77)%、(76.59±5.30)%和(72.40±6.94)%，冰凍血小板對AA、ADP和膠原的聚集率均高于新鮮血小板(P<0.05～0.01)。結論:冰凍血小板的促凝血功能強于新鮮血小板，在血源日趨緊張的今天，可以大量長期儲備冰凍血小板，以滿足臨床應用血小板的需求。

【關鍵詞】冰凍血小板;新鮮血小板;促凝功能

【中圖分類號】R-33【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)16-028-2

機采新鮮濃縮血小板，簡稱新鮮血小板。目前臨床上廣泛應用機采新鮮血小板輸注治療血小板減少性疾病，但由于機采新鮮濃縮血小板的來源有限，滿足不了臨床的需求，便應用冰凍新鮮血小板的臨床輸注[1]。冰凍血小板雖然具有保存期長、無污染危險、使用方便、隨用隨取以及有利于出血性危重患者的及時搶救治療等優點[2]，但其促凝功能與新鮮血小板不同。β-血小板球蛋白(β thromboglobulin，β-TG)、血小板α-顆粒膜蛋白-140(granule membrane protein 140，GMP-140)和血小板第4因子(platelet factor 4，PF4)是血小板特異性球蛋白，在血小板活化時由血小板內的α顆粒釋放[3，4]，測定β-TG、GMP-140和PF4的含量可反映血小板的促凝功能。本文比較了冰凍血小板和新鮮血小板的輸注后機體促凝功能變化。

1材料與方法

1.1血小板制品

冰凍血小板和機采新鮮血小板均來自汕頭市中心血站。新鮮血小板使用MCS+血細胞分離機(美國血液技術公司)采集，供者均符合《衛生部獻血者健康檢查標準》，機器連續采集獻血者全血3000～4000ml，獲得濃縮血小板懸液終體積220～250ml為1個治療量，其血小板數值>215×1011，于當日采集后3h內輸注，輸注量為1個治療量。采集出的新鮮血小板在無菌條件下注入濃度為4%～6%的二甲基亞砜，置于-8°C以下冰箱內保存即為冰凍血小板，保存期為半年。

1.2血小板輸注

隨機選擇100名志愿輸注新鮮血小板或冰凍血小板患者，輸注前分別先抽取新鮮血液2ml。分別取50份冰凍血小板和50份新鮮血小板懸液，每份20單位。冰凍血小板輸注前置42°C恒溫箱解凍，經生理鹽水洗滌。采用隨機輸注方法，輸注24小時后再分別抽取新鮮血液2ml。

1.3β-TG、GMP-140和PF4檢測

將輸注前后分別抽取的新鮮血液，3000×g離心20min，取上清液，采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosor

-bent assay，ELISA)檢測β-TG、GMP-140和PF4。試劑采用羅氏公司(Roche Diagnostics)的ELISA試劑盒，變異度分析控制在15%以內。

1.4血小板聚集功能

采用Born氏比濁法[5]檢測輸注前后血小板的聚集率，所用誘導劑的終濃度為花生四烯酸(arachidonic acid，AA)782.0micro;mol/L、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)47.6micro;mol/L和膠原(collagen)4.8mg/L。

1.5統計學分析

數據按公式“促凝功能變化=輸注后促凝功能-輸注前促凝功能”，以x±s表示，采用SPSS軟件包進行完全隨機化設計資料的方差分析。

2結果

2.1輸注前后冰凍血小板和新鮮血小板β-TG的表達情況

圖1 冰凍血小板和新鮮血小板β-TG的表達情況

*:與冰凍血小板相比，P<0.05

ELISA檢測顯示，輸注冰凍血小板后β-TG為51.5±4.4ng/ml，輸注新鮮血小板β-TG為40.3±4.0ng/ml，輸注冰凍血小板后釋放的β-TG高于新鮮血小板(P<0.05)(見圖1)。

2.2輸注前后冰凍血小板和新鮮血小板GMP-140的表達情況

ELISA檢測結果表明，輸注冰凍血小板后GMP-140為32.1±6.8ng/ml，輸注新鮮血小板后機體GMP-140為24.3±4.8ng/ml，輸注冰凍血小板后GMP-140高于新鮮血小板(P<0.05)(見圖2)。

圖2 冰凍血小板和新鮮血小板GMP-140的表達情況

*:與冰凍血小板相比，P<0.05

2.3輸注前后冰凍血小板和新鮮血小板PF4的表達情況

ELISA檢測結果表明，輸注冰凍血小板后PF4為25.5±4.9ng/ml，輸注新鮮血小板后PF4為18.8±3.6ng/ml，輸注冰凍血小板后PF4高于新鮮血小板(P<0.05)(見圖3)。

圖3 冰凍血小板和新鮮血小板PF4的表達情況

*:與冰凍血小板相比，P<0.05

2.4輸注冰凍血小板和新鮮血小板后機體的聚集功能

在AA、ADP和膠原的誘導下，冰凍血小板的聚集率均高于新鮮血小板(P<0.05～0.01)(見表1)。

表1 冰凍血小板和新鮮血小板的聚集率(%)

組別誘聚劑

AAADP膠原

冰凍血小板

新鮮血小板81.15±6.39

76.11±5.77*83.04±6.09

76.59±5.30*81.25±8.28

72.40±6.94**

注:*:與冰凍血小板相比，與P<0.05;**:與冰凍血小板相比，與P<0.01。

3討論

血小板的功能包括粘附、聚集和促凝等方面，從廣義上講，血小板的粘附和聚集也屬于促凝功能[6]。臨床上，無論是靜脈出血還是動脈出血，輸注血小板的目的都是為了盡快止血，因而血小板的促凝功能是最關鍵的。

β-TG是血小板α顆粒合成的特異性蛋白，由四條肽鏈組成，通過抑制血管內皮細胞生成前列環素(prostacyclin，

PGI2)而發揮促凝作用[7]。由于β-TG主要存在于血小板中，因此測定血小板釋放的β-TG已成為反映血小板促凝功能的一項指標。GMP-140是血小板激活脫顆粒反應中α顆粒釋放的遺留產物，在血小板被激活時被釋放出來，可促進細胞之間的連接，具有介導活性血小板與內皮細胞相互作用的功能，在凝血過程中起重要作用。因而GMP-140也是反映血小板促凝活性的分子標志物之一[8]。PF4是血小板α顆粒中的另外一種活性因子，為四聚體糖蛋白，由相同的70個氨基酸單體以共價鍵結合，單體的相對分子質量為7800。每個單體的N末端具有可變區，單體通過此區以兩個二硫鍵錨定在PF4蛋白質核心上，此區由3個非平行β折疊和一個α螺旋結構組成[9]。PF4在血小板粘附、聚集、活化時以蛋白多糖復合物的形式從血小板中釋放，能降低內皮細胞表面硫酸乙酰肝素的抗凝作用，并使血小板聚集，促進血液在血管內皮細胞表面凝固，因此PF4也是反映血小板促凝反應的標記物[10]。我們的研究結果表明，機體輸注冰凍血小板后釋放β-TG、GMP-140和PF4多于輸注新鮮血小板，說明輸注冰凍血小板后機體的促凝功能強于輸注新鮮血小板。

我們在實驗中還發現，在AA、ADP和膠原分別作為誘聚劑的情況下，輸注冰凍血小板后的血液聚集率均高于輸注新鮮血小板后。血小板聚集是血小板的主要功能之一，在止、凝血過程中，血小板聚集起著關鍵的作用[11]。因此，血小板聚集功能在一定程度上反映了血小板的促凝活性。此外，Owens[12]等報道患者輸注新鮮血小板后，血小板的粘附能力只有輸注冰凍血小板的53%，提示冰凍血小板的粘附功能也強于新鮮血小板。冰凍血小板的粘附能力和促凝活性增強可能與冰凍后血小板對于凝血因子V的結合能力增強有關。劉景漢[13]等通過觀察大量血小板輸注的臨床病例，發現冰凍機采血小板的止血效果優于常規保存液體血小板，尤其是冰凍血小板輸注取得了滿意療效。在該試驗中，我們發現輸注冰凍血小板后機體的促凝功能明顯優于輸注新鮮血小板后。我們在臨床工作中也發現，冰凍血小板輸血反應的發生率低于新鮮血小板，而且取得了較為滿意的效果。滕本秀等[14]則通過臨床實踐，證實了冰凍新鮮血小板除了具有新鮮血小板的優點外，還具有保存期長，無污染危險，使用方便，隨用隨取等優點，因而更有利于危重出血患者的搶救治療。但輸注冰凍血小板之后，血小板計數的增加不及輸注新鮮血小板后明顯[15]。

綜上所述，冰凍血小板的促凝血功能強于新鮮血小板，并且有充足的時間進行病毒檢測，減少了傳染性疾病傳播的風險。雖然冰凍血小板在提升血小板計數方面不及新鮮血小板，但是在血源日趨緊張的今天，經深低溫保存的冰凍血小板在安全性和止血效果方面均尤于新鮮血小板，可以大量長期儲備，以滿足臨床應用血小板的需求。

參考文獻

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