反相高效液相色潽法測定復方養陰生肌散中龍膽苦苷含量的研究

【摘要】目的:建立反相高效液相色譜法測定養陰生肌散中龍膽苦苷的含量。方法:色譜柱:Aglient XDB-C18(250*4.6mm);流動相:水-乙腈(80:20);流速:1.0ml﹒min-1;檢測波長:254nm。結果:龍膽苦苷在20～110ug﹒ml-1范圍里線性關系良好，平均回收率為98.10%，符合分析要求。結論:所建方法操作簡便、結果準確，重復性好，可用于該制劑的質量控制。

【關鍵詞】高效液相色譜法;復方養陰生肌散;龍膽苦苷

【中圖分類號】R927.2【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)16-017-2

復方養陰生肌散是由青黛、龍膽草、黃柏、薄荷、甘草等多味中藥組成的復方制劑。由于成分復雜，各味藥的含量均不是很高，有效成分濃度相對較低，傳統的TLC法定量分析難以達到準確分析，誤差太大，很難達到定量分析的目的，因此，有必要創建HPLC法測定其主要含量。龍膽草是處方主要組成部分，其指標成分龍膽苦苷(Gentiopicrin)不僅性質穩定且單味藥的提取率高，因此建立復方養陰生肌散中龍膽苦苷的高效液相色譜法，可用于檢測處方藥的提取工藝，監控復方養陰生肌散的制劑質量。方法簡便、迅速、準確，重現性好。

1儀器與試藥

Aglient 1100高效液相色譜儀;Aglient紫外檢測器;KQ2200型超聲波清洗儀;TGL-16C型離心機;減壓真空干燥器。

龍膽苦苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號:11070-200810);乙腈為色譜醇;水為重蒸水;所用其它試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱:Aglient XDB-C18(250*4.6mm);流動相:水-乙腈(80:20);流速1.0ml﹒min-1;檢測波長:254nm;進樣量:10μl;柱溫:25.0℃;外標法。理論塔板數按龍膽苦苷峰計算不得低于3500。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液

取龍膽苦苷對照品置五氧化二磷減壓干燥器中放置12小時以上，精密稱定，用甲醇配制成濃度為0.8mg﹒ml-1的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液

取本品約1.84g，精密稱定，置50ml燒杯中，加甲醇適量，超聲10min，放至室溫，過濾到25ml的容量瓶中，再用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。再精密移取上述溶液8ml至25ml容量瓶，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液

取除龍膽草外處方中其它藥材，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.3專屬性實驗

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件操作，記錄色譜圖。結果供試品與對照品溶液均在相同保留時間出現吸收峰，空白溶液在此處無吸收峰，即本試驗條件下龍膽苦苷與其它組分分離完全。結果見圖1。

2.4線性關系考察

取龍膽苦苷對照品適量，精密稱定，制備濃度為0.41mg﹒ml-1的對照品儲備液，精密吸取對照品儲備液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml分別置10ml容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，依次進樣10μl，記錄峰面積。以濃度-峰面積進行回歸，所得線性方程為:y=12519x+23859，相關系數:r=0.9998(n=5)，結果表明龍膽苦苷在20～110ug﹒ml-1范圍內線性關系良好。

圖1 養陰生肌散龍膽苦苷專屬性考察

A-陰性溶液;B-供試品溶液;C-龍膽苦苷對照品溶液

2.5精密度試驗

精密吸取同一濃度龍膽苦苷對照品溶液(82ug﹒ml-1)，重復進樣7次，進樣量10μl，以龍膽苦苷峰面積計算，RSD為0.89%(n=7)。結果表明，精密度較好。

2.6重復性試驗

分別取同批樣品粉末6份，精密稱定。按“2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下條件進樣分析。計算樣品中龍膽苦苷含量，結果RSD為1.25%。結果表明，重復性較好。

2.7加樣回收試驗

采用加樣回收法，取樣品適量，精密稱定，分別精密加入已知含量的低、中、高濃度的龍膽苦苷對照品，按“2.1”“2.2”項方法操作，計算回收率。結果見表1。

表1 回收率測定結果

測得量 (ug)加入量標準品(ug)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)

77.0178.6897.8898.100.41

76.3778.6897.06

77.378.6898.25

102.92104.9198.11

103.08104.9198.26

102.55104.9197.75

118.86120.6598.52

119.07120.6598.69

118.68120.6598.37

2.8樣品測定

取三批樣品。按“2.2”項方法制樣，按“2.1”項條件操作，計算三批樣品中龍膽苦苷的平均含量為0.63%，RSD=1.58%。

3討論

3.1檢測波長的選取龍膽苦苷的最大吸收波長在274nm處，當采用274nm為檢測波長時，檢測靈敏度較高，但相應雜峰增多，基線不平穩，分離度較差，當采用254nm為檢測波長時，基線平穩，分離度好。此外在254nm處同一流動相下還可以檢測到處方中另外一味藥的有效成分，而且兩中成分的呈基線分離。因此，選取254nm作為檢測波長。

3.2含量測定時對提取溶劑和提取方法做了正交試驗考察，結果甲醇超聲提取時干擾最少，含量最高。對不同的流動相及同種流動相的不同比例進行考察，結果流動相為乙腈-水(20-80)時，峰高、分離度和理論塔板數都比較好且基線平穩。此外，用乙腈-水(20-80)作流動相還可以在同一檢測波長下分離復方中藥中的另外一味有效成分。

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