噬菌體生物擴增法檢測肺泡灌洗液結核分枝桿菌的臨床研究

【摘要】目的:探討噬菌體生物擴增法(phaB)檢測肺泡灌洗液中結核分枝桿菌的臨床應用價值。方法:收集疑診為肺結核，未予抗結核的初治患者肺泡灌洗液標本80例，同時應用PhaB法、熒光涂片法、聚合酶鏈反應技術法(PCR檢測法)、羅氏培養法進行檢測，對照分析檢測結果。結果:80例患者纖支鏡檢查有46例發現異常，使用PhaB法、熒光涂片法、聚合酶鏈反應技術、羅氏培養法檢查陽性率分別為58.8%、47.5%、65%、76.3%;PhaB法和聚合酶鏈反應技術兩種方法聯合檢測敏感性為88.5%，特異性為89.5%。結論:PhaB檢測疑診為肺結核的未予抗結核患者肺泡灌洗液結核分枝桿菌，有較高的敏感性和特異性，聯合熒光涂片法和聚合酶鏈反應技術檢測可進一步提高其敏感性。

【關鍵詞】噬菌體生物擴增法;聚合酶鏈反應技術;結核;分枝桿菌

【中圖分類號】R378.91+1【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)16-159-2

結核分枝桿菌感染人體而引發的結核病是全球性的嚴重危害人類的傳染性疾病之一。我國作為發展中國家，結核病的控制更是任重道遠。在結核病控制中，尋求經濟，快速，敏感性和特異性較高的結核菌檢測方法，為結核的早期診斷提供依據是眾多臨床醫師所希望。目前痰熒光涂片靈敏度較差，并受痰樣本數和病情的影響，一般認為活動性肺結核涂陽率約40-50%[1];羅氏培養法陽性率較高約50-80%[1]，但需要平均時間約4-8周。本研究通過PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測法、羅氏培養法檢測肺泡灌洗液中結核分枝桿菌，通過對照評價PhaB法在肺結核診斷中的使用價值及優缺點。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2008-2010年廣州市胸科醫院疑診初治肺結核住院患者80例，其中男性35例，女性25例，年齡19～65歲，平均年齡38.5±7.5歲。入選條件:疑診為初治肺結核并支氣管結核，未開始抗結核治療;三個月內未接受喹諾酮類和氨基糖甙類抗生素治療。

1.2方法

1.2.1PhaB法結核分枝桿菌噬菌體生物擴增試劑盒(FAST plaue TB)由英國BDTEC公司生產，由上海市金浩科技發展有限公司提供。

1.2.2支氣管沖洗液標本收集按支氣管鏡檢查常規進行術前準備和麻醉，通過胸部CT或胸片初步確定重點檢查部位。氣管鏡經鼻腔進入，通過聲門逐步檢查氣管，支氣管。對鏡下可見病變部位，可先后進行支氣管粘膜活檢和支氣管刷檢，隨后進行支氣管沖洗，將生理鹽水5～10毫升注入相應的肺葉和肺段病變部位進行沖洗，用吸引器將沖洗液收集入標本瓶中送檢，共2-3次。對鏡下病變部位不明顯處，將纖支鏡插入病灶最多部位所在的支氣管開口按上述方法進行刷檢、沖洗，留取標本。

1.2.3噬菌體生物擴增法按試劑盒(FASTPlaqueTBTM)說明書配制所需試劑，包括培養基-生物添加劑、瓊脂、噬菌體和敏感細胞等，全部操作在無菌操作臺進行。肺泡灌洗液洗標本的處理:取灌洗液標本5ml，加入1倍體積的4%NAOH溶液混勻常溫靜置15min去污染。加入磷酸緩沖液(PH6.8)離心20min，棄去上清液。重懸沉淀物，4000g離心15min，棄去上清液，重懸沉淀物，無菌條件下吸取1ml重懸液加入孵育管中，37℃孵育24小時。檢測:每次取1ml處理后的樣品加入各反應管中，陰性對照不加標本，陽性對照加入1:1000稀釋度的敏感細胞液。加入100ul噬菌體溶液在37℃條件下培育1h。在每個反應管中加入100ul強效殺毒劑溶液，上下充分混勻，室溫放置5min后加入5ml培養基-生長添加劑和1ml敏感細胞液。將反應管中所有反應混合物倒入培養皿中，加入5ml融化的瓊脂，快速混勻靜置成型。37℃溫育18-24小時后觀察結果。結果判斷:噬菌斑數≦19個陰性，≧20個位陽性。

1.2.4其他檢測方法熒光涂片法:用金胺“O”熒光染色涂片法，熒光顯微鏡檢每50個視野≥10-99條抗酸桿菌為陽性;結核菌培養:用BacT/Alert3D全自動分枝桿菌快速培養儀按照儀器使用說明書進行臨床標本的分離培養;熒光定量聚合酶鏈反應技術(PCR檢測):檢測沖洗液結核分枝桿菌DNA片段，TB-DNA基因拷貝數量>1×103拷貝/mL陽性

1.2.5統計學處理采用SPSS統計軟件進行分析，用X2檢驗比較不同檢測方法的陽性率，P<0.05為差異有統計學上意義。

2結果

初步診斷為肺結核合并支氣管內膜結核的，未予抗癆治療的纖支鏡肺泡灌洗液標本80例。使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測法、羅氏培養法四種檢測方法，PhaB法陽性率58.8%，熒光涂片法陽性率為47.5%，PCR檢測法陽性率65%，快速培養法陽性率76.3%。其中，PhaB法檢測陽性率明顯高于熒光涂片法，檢驗差異有顯著性意義(X2=4.27，P<0.05);PhaB法和聚合酶鏈反應技術法檢出率無顯著性差異(X2=1.78，P>0.05)，提示兩者陽性檢出率類似;PhaB法與羅氏培養法比較檢驗有顯著性差異(X2=12.07，P<0.05)，提示對比羅氏培養法PhaB法陽性檢出率稍差。聯合①②③陽性檢出率為82.5%和④比較(X2=0.09，P>0.05)。

表一 80例初步診斷肺結核肺泡灌洗液使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測法、羅氏培養法進行檢測陽性結果

方法標本例數陽性例數陽性檢出率(%)

①PhaB法804758.8

②熒光涂片法803847.5

③PCR檢測805265

①③兩種方法聯合805872.5

④羅氏培養法806176.3

PhaB法檢出的47份陽性標本中，熒光涂片法檢出35例陽性;PhaB法檢出的33份陰性標本中，熒光涂片法檢出30例陰性。PCR法檢測的52份陽性標本中，PhaB法檢出41份，檢出率78.8%;羅氏培養法陽性的61例標本中，PhaB法檢測出44份，檢出率72.1%。

表二 80例初步診斷肺結核肺泡灌洗液使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測法、羅氏培養法進行檢測結果比較

熒光涂片法PCR檢測法羅氏培養法

陽性陰性陽性陰性陽性陰性

PhaB法陽性(n=47)3512452470

陰性(n=33)3307261419

合計384252286119

3討論

1997年wilson等[2]人發現眾多的噬菌體中有一種分枝桿菌噬菌體能感染結核分枝桿菌和少數幾種非結核分枝桿菌。在經過處理的標本中加入結核分枝桿菌噬菌體，使噬菌體和分枝桿菌結合，隨后加入殺毒劑滅活未感染分枝桿菌的噬菌體。噬菌體在受感染的分枝桿菌內，利用其代謝酶系進行大量繁殖。當分枝桿菌破裂，大量的子代噬菌體被釋放，感染加入的敏感指示細菌，在培養基上經培養形成噬菌體空斑。當空斑數量>20個為陽性，否則為陰性。陽性的標本間接提示原標本有結核分枝桿菌或少數的幾種非結核分枝桿菌。這構成了噬菌體法檢測分枝桿菌的理論基礎[3]。據國外資料報道，2002年南非Albert[4]等人對疑似肺結核患者，以羅氏培養法為金標準，噬菌體法對痰標本檢測的敏感性73%，特異性為99%;巴基斯坦Muzaffar[5]等人用類似方法測得噬菌體法的敏感性82%，特異性98%;國內于秀麗[6]等人用BACTEC MGIT980快速培養法作為金標準，測得噬菌體法檢測痰中結核分枝桿菌的敏感性為86.4%，特異性83.9%。均顯示噬菌體法對痰中分枝桿菌檢測有較高的敏感性和特異性。

本研究用噬菌體生物擴增法、熒光涂片法、聚合酶鏈反應技術、羅氏培養法共4種方法同時檢測不同的纖支鏡肺泡灌洗液標本80份。PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測法、羅氏培養法陽性檢出率分別為58.8%，47.5%，65%，76.3%。PhaB法和熒光涂片法陽性率比較，差異有顯著性意義(X2=4.27，P<0.05)，說明PhaB法比熒光涂片法有更高的敏感性。國內未見有相關文獻報道。PhaB法和PCR檢測法陽性檢出率比較無顯著性差異(X2=1.78，P>0.05);噬菌體生物擴增法以羅氏培養法為金標準，結果提示其敏感性77%，特異性100%，陽性預測值100%，陰性預測值57.6%。和國外以痰標本PhaB法檢測報道結果相似[4]。聯合PhaB法和熒光涂片法檢測敏感性為81.2%，特異性為100%，陽性預測值100%，陰性預測值57.6%;聯合PhaB法和PCR檢測法檢測敏感性為88.5%，特異性為89.5%，陽性預測值96.3%，陰性預測值89.5%。提示聯合PhaB法和PCR檢測法，能快速診斷肺結核，有較高的敏感性和特異性，在臨床中可能有較大的實用價值。這有待于更大的標本量進一步驗證。

結核分枝桿菌細菌學檢測是診斷結核的金標準之一，但患者排菌情況受結核病發現時期較大影響，對早期以滲出、增殖為主的病理改變，排菌量較小;而發生壞死，空洞形成的患者相對排菌量較大。同時病灶相連的支氣管引流是否通暢也影響遠端氣管內分泌物的排出，影響到痰結核菌的檢查。本組病例肺泡灌洗液標本PhaB法陽性檢測率較高，除了與病例的選擇有關，考慮原因:支氣管鏡檢查對支氣管、肺泡的機械性刺激，活檢鉗和毛刷損傷支氣管壁和病灶邊緣，同時在在纖支鏡活檢和刷檢后灌洗可起到疏通支氣管，促進遠端分泌物的排出。用生理鹽水在病變部位注入遠端氣道和肺實質，接觸病灶范圍較廣，負壓吸引收集沖洗液較多，細菌量較大，深部的結核菌可能被收集到沖洗液中。肺泡灌洗液對支氣管有刺激作用，可以誘發部分患者咳嗽，有利于深部結核菌的排出，獲得結核菌的機會增多[7]。另外，PhaB法是通過噬菌體感染結核分枝桿菌，而結核分枝桿菌受一些理化因素作用，表面受體發生細微變化可能導致不能被噬菌體感染[8]。相對痰標本，肺泡灌洗液標本受理化因素影響較小。

總結噬菌體生物擴增法對肺泡灌洗液標本分枝桿菌檢測的臨床應用。PhaB法操作簡便，獲取結果快速(2天)，相對熒光涂片法有較高的敏感性和特異性。對PhaB法分枝桿菌檢測高特異性，臨床可以用于結核桿菌和非結核分枝桿菌的菌種鑒定[9]。針對噬菌體必須感染活的結核菌特性，臨床中還可以對標本加入不同的結核藥，對照不加藥標本，篩查結核菌株對不同結核藥的耐藥性[2]。

參考文獻

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