SDF-1對創緣表皮干細胞定向趨化及促創面愈合效應的研究

[摘要]目的:觀察干細胞趨化因子SDF-1在創面愈合過程中調控表皮干細胞定向遷移促進創面愈合的過程。方法:制作大鼠背部全層皮膚缺損模型，隨機分為三個實驗組:①SDF-1組;②AMD3100(CXCR4受體的拮抗劑)組;③空白對照組。分別于致傷后1天、3天、5天、7天和12天照相計算傷后不同時間創面占初始創面的百分比并取材。運用HE染色和免疫組化技術觀察創緣表皮干細胞定向遷移分化的特點，尋找其規律。結果:與其他兩個處理組相比，SDF-1處理組愈合時間縮短，其創緣皮表皮基底層細胞分裂增殖旺盛，創緣表皮干細胞數目明顯多于其他兩組。結論:在創面愈合過程中，SDF-1可以調控表皮干細胞向創緣遷移，加速創面上皮化。

[關鍵詞]基質細胞衍生因子-1;表皮干細胞;創面愈合

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)08-1156-05

SDF-1 accelerates wound healing via recruitment of epidermal stem cells

ZHANG Yi1，GONG Xi-yuan1，SUN Xue-wu1，QIU Xiao-dong1，GUO Dan-feng1，ZHANG Guan-jun1，HAN Ji-qin1，

CAO Chuan2

(1.Department of Plastic Surgery，Jinan Central Hospital of Shandong University，Jinan 200013，China; 2.Department of Plastic Surgery，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the stem cell chemokine SDF-1 in the regulation of wound healing migration of epidermal stem cells to promote wound healing process.MethodsRat dorsal full-thickness skin defects were randomly divided into three experimental groups: ①SDF-1 group; ②AMD3100 (CXCR4 receptor antagonist) group;③control group. 1 day，3 days，5 days，7 days and 12 days after injury camera calculates the wound at different times，and total percentage of the initial wound drawn. Using HE staining and immunohistochemical observation of a margin of epidermal migration and differentiation of stem cell characteristics，to find its own rules. ResultsCompared with the other two treatment groups，SDF-1 treatment to shorten healing time，the margin of skin epidermal basal cell division and proliferative margin of the number of epidermal stem cells was more than the other two groups.ConclusionIn the wound healing process，SDF-1 can regulate epidermal stem cells migrate to the wound edge，accelerate wound epithelization.

Key words:SDF-1; epidermal stem cells; wound healing

位于表皮基底層的表皮干細胞是皮膚組織發生、創面修復與改建的關鍵細胞[1-2]。β1整合素和角蛋白19(Keratin-19 K19)染色呈陽性為其鑒別手段[3-4]。研究發現，創面修復過程中表皮干細胞可向創緣定向遷移[5]。理論上講，這種遷移趨勢是由趨化因子與其靶細胞膜上特異性受體結合，從而調控這些細胞的遷移、增殖和分化來發揮促修復作用。基質細胞衍生因子-1(stromal cellderived factor-1 SDF-1)和其受體CXCR4廣泛表達于多種組織細胞，對一些組織器官發育和損傷后修復再生起重要調節作用。我們前期工作發現，細胞免疫熒光染色顯示表皮干細胞表面CXCR4受體表達呈陽性，應用流式細胞儀檢測表皮干細胞表面CXCR4抗原陽性率為43%，且創面在愈合過程中的創緣組織勻漿內的SDF-1表達量明顯增多[6]，由此我們猜測在創面愈合過程中，SDF-1/CXCR4軸有可能參與調控創緣表皮干細胞向創面內遷移從而促進創面修復過程。

1材料和方法

1.1 主要設備及試劑:石蠟切片機，德國LEICA公司生產;實驗攝像顯微鏡，日本Olympus生產。

AMD3100由美國Sigma公司提供;SDF-1因子由美國peprotech公司提供;K19抗體(Keratin19 Ab-1)由NeoMarker公司提供(小鼠來源);β1整合素抗體(β1 Integrin Ab-1)由Chemicon International公司提供(小鼠來源);過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase)試劑盒和DAB染色試劑盒由北京中杉生物技術有限公司提供;戊巴比妥鈉由上海行知化工工廠提供。

1.2 動物模型的制備:出生50天的健康清潔級SD大鼠90只，雌雄不限，由第三軍醫大學附屬大坪醫院動物所提供。隨機分為3組:SDF-1組、AMD3100組、空白對照組。1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射后，鼠背部脫毛，用直徑為6mm的打孔器制作2個全層皮膚缺損的圓形創面。三個治療組于致傷后即刻、1天、2天、3天、4天分別在創緣注射SDF-1因子1μg，AMD3100 125μg，生理鹽水0.1ml，1次/天，隨后觀察創面愈合情況。

1.3 致傷后處理及取材:所有實驗動物均行肉眼觀察，并記錄創面愈合情況(創面愈合以創面完全封閉且完全上皮化為判定標準)。三組在致傷后1天、3天、5天、7天和12天隨機處死5只大鼠，取背部2個創面的創緣組織(附帶部分正常皮膚組織)，置于10%甲醛液內固定。常規石蠟包埋，系列切片，進行HE染色、β1整合素和K19染色。免疫組化檢測采用鏈親和素-過氧化物(Streptavidin/Peroxidase，SP)法。小鼠抗大鼠β1整合素多克隆抗體(工作濃度1:1000)，小鼠抗大鼠K19單克隆抗體(工作濃度1:1000)。實驗操作嚴格按試劑盒說明說進行，DAB顯色，蘇木精復染。另外以PBS代替β1整合素多克隆抗體、K19單克隆抗體作為空白對照。

1.4 觀察指標

1.4.1 創面面積計算:用數碼相機拍攝鼠背部創面及創面旁的標尺，以標尺校準創面面積大小，應用Image J軟件分析測量創面面積。

1.4.2 免疫組織化學染色陽性細胞的判定:結果以細胞膜(β1整合素)、細胞漿(K19)呈棕黃色著色為強陽性，黃色著色為陽性，淡黃色為弱陽性。

1.4.3 統計學處理:統計學分析采用SPSS10.0統計軟件作單因素方差分析，結果以x±s表示。以P﹤0.05作為統計學差異顯著，P<0.01視為統計學差異非常顯著，P﹥0.05視為統計學差異不顯著。

2結果

2.1 大體觀察結果:三組大鼠在致傷3天后，濕潤的創面逐漸變干燥，無異味、滲出，SDF-1組創面稍有皺縮，其它兩組變化則不明顯。致傷后5天，SDF-1組大鼠創緣開始出現肉眼可見的新生粉紅色上皮組織，空白對照組和AMD3100組大鼠創面則變化不明顯;致傷后7天，空白對照組大鼠創面開始縮小，創緣出現肉眼可見的新生上皮組織。7天后SDF-1組的創面面積為初始面積的51.8%，11天后創面基本愈合。而空白對照組在致傷后7天的創面面積為初始面積的56.1%，13天后創面愈合。AMD3100組在致傷后7天的創面面積為初始面積的59.9%，15天后創面基本愈合(結果見表1)。

2.2 組織學觀察

2.2.1 HE染色:傷后1天，SDF-1組創緣表皮基底層細胞排列疏松，胞漿淡染，細胞核仁明顯，細胞呈現出明顯分裂增殖狀態(圖1);空白對照組創緣表皮基底層細胞排列較為規整，可見少量胞漿淡染，核仁形成的細胞(圖2);而AMD3100組創緣基底層細胞排列較為疏松，無明顯的核仁形成(圖3)。傷后3天，SDF-1組創緣表皮層明顯增厚，表皮層細胞呈現向創面內遷移的趨勢，遷移細胞大都胞漿淡染，且核仁明顯，基底層細胞增大，排列疏松，呈現出旺盛的增殖狀態(圖4);空白對照組創緣表皮增厚不明顯，但可見向創面遷移的表皮基底細胞，其形態比正常基底細胞稍大，胞漿淡染，核仁明顯(圖5);AMD3100組創緣基底排列較為疏松，未見明顯向創面遷移的細胞(圖6)。傷后7天，SDF-1組新生表皮組織內可見除角質層外的排列規則的各層細胞(圖7);空白對照組創緣可見明顯增厚由基底細胞和棘細胞構成的新生表皮，細胞排列疏松(圖8);AMD3100組創緣開始出現少量細胞淡染、核仁明顯的基底細胞，并出現向創面內遷移的趨勢，但創緣新生表皮層數明顯少于其他兩組(圖9)。

2.2.2 K19免疫組化染色:傷后1天，三個處理組創緣表皮細胞均未見明顯陽性表達(圖10、11和12);傷后3天，SDF-1組創緣表皮棘細胞層和基底層細胞胞漿呈強陽性表達(圖13);空白對照組創緣表皮基底細胞有少量細胞胞漿表達陽性(圖14);而AMD3100組創緣表皮細胞無陽性表達(圖15);傷后7天，SDF-1組創緣表皮增厚，創面內可見大量胞漿表達陽性的表皮細胞嵌入，基底細胞體積增大，排列松散，可見核仁形成(圖16);空白對照組創緣陽性細胞較傷后3天明顯增多，但陽性細胞數少于SDF-1組(圖17);AMD3100組創緣表皮可見散在的陽性細胞，表達較弱(圖18)。

2.2.3 β1整合素免疫組化染色:傷后1天，SDF-1組創緣表皮基底有少量膜染色陽性的細胞(圖19);空白對照組和AMD3100組創緣表皮胞膜均無陽性表達(圖20和圖21);三組表皮細胞均無向創面遷移的趨勢。傷后3天，SDF-1組創緣表皮大量細胞胞膜染色陽性，且陽性細胞散在分布于創面內(圖22);空白對照組創緣表皮細胞胞膜開始出現棕黃色著色，但數量較少(圖23);AMD3100組創緣表皮細胞無陽性表達(圖 24)。傷后7天，SDF-1組創緣表皮層可見更多的膜表達陽性細胞分布(圖25);空白對照組創緣表皮層陽性細胞也逐漸增多，但數目明顯少于SDF-1組(圖26);AMD3100組創緣表皮層開始出現膜陽性的細胞分布，但數量明顯少于其他兩組(圖27)。

3討論

在創面愈合過程中，趨化因子不僅能促進原位細胞遷移、炎癥細胞浸潤，還可以促進皮膚上皮化修復，組織重塑和血管生成[7]。SDF-1在許多組織內呈組成性表達，SDF-1與其唯一受體CXCR4結合后，對許多生物學過程起重要調節作用。如在生理條件下是淋巴細胞的趨化劑[8];在病理條件下，SDF-1可以募集內皮前體細胞向梗死的心肌病灶內[9]以及腫瘤微循環內遷移[10]。SDF-1/CXCR4在人類正常皮膚上也有表達，這可能與維持皮膚內環境的穩定有關[11]。

表皮層中的基底細胞層內排列著一些體積小、核大、核/漿比例大、細胞內RNA含量低的典型非成熟細胞[12]，即維持皮膚正常更新代謝和修復受損皮膚的表皮干細胞。創緣組織HE染色發現，SDF-1處理組創緣新生表皮層明顯增厚，基底層細胞排列疏松，胞體增大，胞漿淡染，細胞核仁明顯，細胞呈現出明顯分裂增殖狀態，且這些增殖旺盛的細胞大量嵌入創面內。為了驗證嵌入細胞的性質，對創緣組織行K19、β1整合素染色(K19、β1整合素是當今學術界公認的表皮干細胞的標志物[4，12])，發現創面愈合過程中創緣基底層陽性細胞由下至上向創面內遷移，且創緣陽性細胞數逐漸增多，而這種遷移效應可以被AMD3100阻斷，由此我們認為創面可以通過分泌SDF-1調控表皮干細胞遷移，修復受損創面。

除此之外，SDF-1可以促進內皮細胞的增殖和遷移，加速新生血管生成[13];SDF-1還促使造血前體干細胞從造血微環境向外周組織內遷移，并使這些細胞在外周組織內定居，修復受損組織[14]，這些從骨髓動員至外周的干細胞也可能參與創面修復。Toksoy[15]認為在創面愈合過程中內皮細胞和成纖維細胞是分泌SDF-1的主要細胞。與內皮細胞類似，成纖維細胞在傷口愈合過程中增殖也受到了SDF-1的調控。成纖維細胞的增殖活力與SDF-1的分泌量密切相關。在傷口愈合的晚期，SDF-1分泌量下降，成纖維細胞的增殖效應終止同時基質合成量減少，由富含成纖維細胞的肉芽組織衍化為瘢痕組織。成纖維細胞和角質形成細胞的聯合培養實驗表明細胞的增殖與SDF-1呈正比的量效關系[16]。

綜上所述，SDF-1促進創面愈合是一個通過動員多種細胞參與的過程，它不僅可以促進新生血管的形成、成纖維細胞和角質形成細胞的增殖，還可以趨化表皮干細胞的遷移，加速創面上皮化的進程，這為研究趨化因子治療難治性創面開辟了新的研究思路。

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[收稿日期]2010-06-10[修回日期]2010-07-12

編輯/張惠娟