牽引成骨中細胞因子的表達及作用

牽引成骨技術(distraction osteogenesis，DO)因其能在原位快速成骨而被稱為是一種內源性組織工程技術(endogenous tissues engineer)。自1992年McCarthy首次將DO技術用于下頜骨畸形患者的治療以來，經過十多年的基礎研究與臨床實踐，DO在顱頜面外科缺損修復重建中的臨床運用越來越受到重視。然而，DO的某些并發癥(如骨再生不良、延遲愈合、不愈合)，特別是較長的療程及牽引裝置長時間留置于面部或口腔內所引發的各種問題(如固定螺釘松脫、傷口感染、骨折等)成為臨床運用和推廣該技術的瓶頸和主要障礙[1]。近年來，對DO中新骨形成的分子機制做了大量基礎性研究，證實牽張機械力引起了多種細胞因子基因的表達增加，提示DO過程中多種細胞因子影響著成骨細胞的增殖、分化及細胞外基質的生物合成和礦化。本文就這方面的研究綜述如下。

1轉化生長因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)

TGF-β是一組多功能蛋白多肽，廣泛存在于動物正常組織細胞及轉化細胞中，以骨組織和血小板中含量最為豐富，其在骨形成和骨重建中起著極其重要的作用。TGF-βs能促進成骨細胞、軟骨細胞、間質細胞及前成骨細胞的增殖，同時能有效促進膠原合成及非膠原細胞外基質蛋白的表達;此外，TGF-βs能通過抑制基質金屬蛋白酶的合成和促進金屬蛋白酶組織抑制因子TIMP-1的合成抑制細胞外基質分子的降解[2]。

目前，對DO過程中TGF-β1的表達研究較為深入，多數學者認為TGF-β1在DO的整個過程中均有表達，只是表達水平不同;并且在不同時期表達部位也不同。Mehrara等[3]在鼠下頜DO實驗中發現，在潛伏期末TGF-β1表達較未手術組增加2.5倍，牽張初期增加到正常水平的3倍，并且在整個牽張期都保持高水平，直至固定期第4周末才恢復到正常水平;潛伏期及牽張早期TGF-β1主要在截骨線周圍的炎癥細胞、成骨細胞、間充質細胞、細胞外基質中表達增高;當繼續牽引，則高表達于活性成骨細胞、新生成的血管及細胞外基質中的膠原纖維;固定期TGF-β1表達僅局限于牽張間隙中的成骨細胞。Steinbrech等[4]發現TGF-β1隨牽張的進行而持續表達，并伴有骨基質的輕度礦化和膠原的活躍合成，而且TGF-β1及其受體的表達廣泛存在于皮質切開的骨邊緣、骨膜、周圍軟組織和炎細胞，以及中央纖維形成區的成纖維細胞和各區域的成骨細胞。陳勇等[5]也證實TGF-β1的表達貫穿下頜骨DO的全過程，且TGF-β1mRNA及其蛋白表達在牽引早期達到高峰，此后逐漸減弱，其不同時期表達部位與上述相似。表明牽張機械力刺激可促進TGF-β1的合成和分泌，推測其在牽引成骨中是成骨細胞遷移、分化、胞外基質合成、血管形成的重要調節因子。

然而，外源性TGF-β1對DO中新骨形成作用的研究結果不完全相同。Ozkan等[6]發現外源性TGF-β1增加牽張區新生骨組織的密度和強度;而Rauch等[7]在兔DO實驗中局部應用TGF-β1，結果對成骨量及成骨密度均無影響，僅增加了骨痂區的纖維組織。Seiadini等[8]在對脛骨節段性DO研究中，給予外源性重組人TGF-β，結果發現空白對照組和生理鹽水組骨明顯、連續、穩定、礦化均勻，而注入TGF-β組結果則相反，且隨劑量的增加軟骨和軟骨細胞數量減少，表現出對成骨起抑制作用。表明TGF-βs促進成骨作用在體內可能存在一精確的調節機制，如何利用外源性TGF-βs來促進DO中的骨組織的再生有待進一步研究。

2骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)

BMPs是一種疏水酸性糖蛋白，為TGF-β超家族成員之一，目前已發現的有BMPl-12，其作用具有濃度依賴性，低濃度時能促進細胞趨化和增殖，高濃度時能促進細胞分化和骨形成。Sato等[9]在鼠長骨DO實驗中發現，在截骨后4天，BMP-2、-4mRNA可在骨膜下未成熟骨痂中的軟骨前體細胞中檢測到;截骨后7天，BMP-2、-4mRNA恢復到術前水平;當牽引開始后，BMP-2、-4mRNA在纖維區的軟骨細胞，骨細胞和它們的前體細胞中明顯表達，約是骨切開時表達量的20倍，在整個牽引期維持較高水平;至固定期BMP-2、-4表達消失;而BMP-6、-7在DO中的表達情況與BMP-2、-4的表達不同，牽張初期，BMP-6僅在成軟骨細胞內可以檢測得到，隨著牽張的進行，BMP-6 mRNA表達漸降低，至固定期不表達;BMP-7在整個實驗過程中均未被檢測到。推測BMP-6在軟骨成骨階段可能發揮著一定的作用，BMP-7對其成骨無明顯影響。Rauch等[10]在對兔脛骨施行牽引成骨術時也證實，在潛伏期，BMP-2、-4表達增加，尤其在骨膜的間充質細胞和成骨細胞十分明顯;在牽引期，BMP-2、-4在成纖維細胞和軟骨細胞中表達持續升高;當牽引停止后，表達逐漸下降;但Rauch等發現BMP-7的表達與BMP-2、-4的表達同步，且表達的部位也基本類似。這可能與動物模型的建立、檢測手段和檢測試劑等因素有關。Khanal[11]進行牽引區新生骨組織免疫組化檢查發現，潛伏期BMP-2、-4， Smads 1、5、 8的表達僅輕微增加，牽引期表達顯著增加而進入固定期則逐漸減弱，認為BMP信號通路在將機械應力轉錄為生物學效果中起重要作用。

目前，已證實BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12均有促進新骨形成的作用，其中，以BMP-2促進新骨形成作用最強[12-18]。這些骨形態發生蛋白之間也可能存在協同作用，有文獻報道[19-20]重組BMP-2與BMP-7的聯合基因治療較單一應用其中一個更能促進成骨細胞分化成骨。但目前仍然不知道在牽引過程中產生的機械應力是如何激活機體產生相應生物學信號，尚需進一步研究。

3血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)

血管內皮生長因子也稱血管滲透因子(vascular permeability factor，VPF)，最初是在腫瘤細胞分泌物中發現的，是一種糖基化分泌性多肽因子，具有維持血管正常狀態和完整性，增加血管通透性，誘導血管發生，并促進血管生成的作用。Warren等[21]在鼠下頜骨DO實驗中發現，在截骨后5～7天 VEGFmRNA的表達增加，在牽引1周左右達高峰，其表達貫穿整個牽引期及固定期，在牽引帶成骨細胞和內皮細胞上有高濃度的VEGF表達及強烈的血管生成反應。Byun[22]在狗單側下頜骨DO過程中檢測牽引區VEGF和其兩種受體Flt-1、Flk-1，發現牽引7天后牽引區成骨細胞、骨細胞和成纖維細胞中VEGF和其受體表達明顯增加，并在成骨細胞和成纖維細胞中維持14天。牽引28天后VEGF和VEGFR-1在成骨細胞中表達減弱，牽引區細胞中無VEGFR-2表達。在整個觀察期VEGFR-1明顯強于VEGFR-2的表達。Sojo[23]研究發現VEGF在牽引區新生成骨的前部靠近新生成骨的周邊的成骨細胞表達，而BMP-2、-4在肥大的軟骨細胞中表達。在同一標本中VEGF表達區域比BMP-2、-4表達區域離骨干遠，因此認為在成骨之前先有血管生成。Casap[24]在兔下頜骨牽引一側牽引區應用VEGF后發現應用VEGF部位的新骨生成明顯增加，因此，認為VEGF對新骨形成具有積極的作用。但Eckardt等[25]在對兔牽引動物模型中局部導入VEGF或VEGF拮抗劑，結果未發現對新骨形成有明顯影響。推測可能是因為機械牽張已刺激VEGF等生長因子的大量產生，導入的外源性VEGF或VEGF拮抗劑不足以發揮作用。另外，導入VEGF的時機、劑量及處理方式等都可能影響新骨形成。

4堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)

bFGF是一種25kD的多肽，包括至少19個密切相關的單肽，能促進細胞增殖，調節細胞分化，誘導軟骨和骨基質合成，與血管內皮生長因子協同作用，可促進血管再生，從而促進骨生成。Yeung等[26]研究bFGF在牽引過程中的表達中發現，在延遲期、牽引期、固定期bFGF均有不同程度的表達。在潛伏期，骨膜和骨髓質區的類纖維原細胞bFGF表達較明顯，新形成的成骨細胞也有bFGF的表達;牽引期，正在形成中的骨小梁成骨細胞bFGF有非常強的表達。在新形成骨小梁和纖維組織中，成骨細胞密度比相鄰區域明顯增高，bFGF的表達也更明顯。在固定期bFGF的表達比牽引期明顯減弱。劉人愷等[27]在山羊顱骨縫DO實驗中發現山羊顱骨縫在受到牽張力作用后bFGF有高水平表達，以牽張結束當天與第2周最為顯著，主要定位于成纖維樣細胞與成骨細胞，隨著固定時間的延長其表達逐漸減弱。

應用外源性bFGF可刺激骨痂形成，促進骨折修復和再生、移植骨愈合及骨缺損修復。Okazaki等[28]對兔脛骨行牽引成骨，牽引結束后，局部注入200μg bFGF，發現能促進牽引區骨形成。在牽引結束后2～5周，發現骨礦化量明顯增加，提示在骨牽引的固定期，外源性bFGF的應用可以縮短骨延長時間。將bFGF注入兔脛骨近端骺板后，血管由鄰近干骺端長入，加速骨前體細胞的侵入及軟骨骨化。朱永云等[29]將外源性bFGF注射到兔下頜骨牽引區，顯示牽引區新骨生成速度和數量高于對照組，認為局部導入外源性bFGF可能有促進下頜骨牽引成骨的作用，從而為縮短DO療程和減少牽引后復發回彈提供了一種可能的途徑。

5胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)

胰島素樣生長因子是一類對機體生長發育起重要調節作用并具有胰島素樣代謝效應的因子，目前已發現有IGF-1和IGF-2兩種異構體，分別為含有70個和67個氨基酸的單鏈多肽。IGF-1可由成骨細胞產生并以自分泌方式刺激成骨細胞增殖和基質合成，IGF-2的生理作用與IGF-1相似但作用較弱。Eingartner等[30]研究發現，在DO過程中IGF-l的表達呈現明顯的時間性。在牽引早期，血漿中IGF-1水平最先升高，其后牽引帶和周圍骨組織中IGF-1水平開始升高，這可能是由于受牽引力影響，周圍軟組織最先釋放IGF-1，導致血液中濃度升高的結果。而Meyer等[31]檢測牽引成骨時兔血清IGF-1含量發現，在骨切開后IGF-1血清濃度下降，但牽引期其濃度并無明顯升高。Yates等[32]研究IGF-1在豬下頜DO早期的作用，發現牽引早期骨膜中IGF-1升高明顯，牽引帶僅有少量礦化骨質形成;牽引結束后，IGF-1恢復到正常水平，牽引帶有大量礦化骨形成。說明IGF-1可能在牽引早期發揮重要作用。王志國等[33]在研究局部應用IGF-1對兔下頜骨DO的影響時發現，實驗組和對照組動物在X線片上無明顯差異;在組織學觀察上，兩組在牽張間隙內均見到有大量新生骨小梁生成，骨小梁排列方向與牽引方向一致;組織學分級評價結果顯示，實驗組新骨生成數量僅比對照組多2.4%，但統計學檢驗結果表明兩組未見顯著差異。Schrnid[34]研究發現只有在機體缺乏IGF時，外源性IGF對成骨細胞的分化與增殖才有促進作用。在骨切開術和隨后的牽引過程中，局部組織會產生較高濃度的IGF-1，這時候導入外源性IGF-1顯得多余。另外，聯合應用生長因子可能比單獨應用某一種生長因子更有效。

綜上所述，在牽引成骨術中牽張機械力能促進多種細胞因子的表達，其參與了牽引區新骨形成及礦化的調節，這為闡明牽引成骨的分子機制奠定了基礎;但這些細胞因子表達的時間順序及之間的相互作用還尚不清楚，此外，對于外源性細胞因子應用的時間、途徑及劑量還需深入研究。相信隨著對牽引成骨分子機制的研究深入，必將對臨床應用和研究產生重要的指導意義，推動牽引成骨的廣泛應用。

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[收稿日期]2010-06-07 [修回日期]2010-07-20

編輯/李陽利