CXCR4靶向shRNA質粒載體的制備和體外鑒定

[摘要]目的:設計并構建CXCR4靶向shRNA質粒載體，轉染黑色素瘤細胞株，驗證shRNA對黑色素瘤CXCR4基因的沉默效應。方法:設計合成CXCR4特異性shRNA，將其插入pSilencer質粒載體，并將重組后的pSilencer質粒載體經脂質體包裹轉染黑色素瘤MV3細胞株，抗性篩選穩定抑制CXCR4表達的永久性克隆。應用RT-PCR技術檢測shRNA對黑色素瘤細胞內CXCR4 mRNA表達，應用Western blot法檢測CXCR4蛋白變化。結果:成功構建和篩選出CXCR4特異性的shRNA質粒載體及穩定抑制CXCR4表達的永久性細胞克隆。陽性克隆測序結果表明合成的寡核苷酸鏈序列插入正確。穩定轉染CXCR4-shRNA的高轉移性黑色素瘤細胞MV3的CXCR4 mRNA和蛋白的表達較空白對照組明顯下調。結論:脂質體介導shRNA體內表達法制備的CXCR4-shRNA在黑色素瘤細胞中可獲得高效轉染，并能產生特異性的基因沉默效應，以CXCR4為靶向的shRNA能夠有效下調CXCR4基因的表達，有望為轉移性黑色素瘤的靶向基因治療提供一條新途徑。

[關鍵詞]黑色素瘤;趨化因子受體CXCR4;shRNA;質粒

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)08-1167-04

Construction and in vitro identification of CXCR4 target plasmid vector of short hairpin RNA

WU Bao-jin1，2，JIANG Hua2，LI Wen-peng3，WU Jian-ming2，ZHANG Ying-fan2，DING Wei1

(1.Department of Plastic Surgery，Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai 200003，China; 2.Department of Plastic Surgery，Changzheng Hospital，the Second Military Medical University; 3. Department of Plastic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine)

Abstract:ObjectiveTo construct a CXCR4 specific shRNA recombinant plasmid vector and identify its inhibiting effect on the gene expression of CXCR4 in melanoma cell lines. MethodsA CXCR4 specific recombinant plasmid vector was prepared and transfected into the cultured MV3 cell line with lipofectamine 2000. RT-PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of CXCR4， respectively.ResultsCXCR4 specific shRNA was constructed and transfected into the MV3 cell line. Agarose gel electrophoresis confirmed the vector had been inserted in the production of PCR， and sequencing result showed that composite CXCR4-shRNA inserting correctly in the positive clone. Both the CXCR4 protein and mRNA expression in the CXCR4-shRNA group were significantly lower than that of the control group.ConclusionCXCR4-shRNA can be highly effectively transfected into melanoma cell， and induced post-transcriptional gene silencing of CXCR4， which may become a potential target in the prevention and treatment of invasion and metastasis of melanoma.

Key words:melanoma;chemokin receptor CXCR4;short hairpin RNA; plasmid

RNA干擾 (RNA interference， RNAi)是近年發現的一種調節mRNA的生物學現象，它能使基因表達的mRNA被相應的雙鏈RNA分子敲除，從而引起轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing， PTGS)，其效果遠強于正義和反義RNA[1]。目前研究表明，參與這種RNAi作用的主要分子是雙鏈RNA，在細胞內以21-23個核苷酸的形式發揮作用，而且己有人工合成雙鏈siRNA，具有明顯敲除相應基因mRNA的效果[2]。

近年研究發現，CXCR4在某些腫瘤細胞中表達，并可能在侵襲轉移中發揮著重要作用[3-6]。在黑色素瘤侵襲轉移中對其正相關基因的抑制，是值得探索的思路之一。本研究通過構建CXCR4靶向shRNA的質粒載體，轉染黑色素瘤細胞株，驗證shRNA對CXCR4的沉默作用，為后期進一步研究CXCR4基因沉默阻斷SDF-1/CXCR4信號轉導途徑對黑色素瘤侵襲轉移的影響奠定基礎。

1材料和方法

1.1實驗材料:MV3細胞株系人轉移性黑色素瘤細胞株，B16F10系小鼠高轉移性黑色素瘤細胞株均購自中國科學院上海細胞所細胞庫。pSilencer 3.1-H1 neo質粒購自Ambion公司，內含四環素Ampr抗性基因和人U6啟動子以及新霉素抗性篩選標記。PCR引物由上海申工合成。

1.2人CXCR4 shRNA脫氧寡核苷酸片段shRNA設計:從NCBI GenBank數據庫獲取CXCR4 cDNA的完整序列。根據siRNA設計原理和哺乳動物真核細胞siRNA的Tuschl AA-19nt的設計原則，應用Ambion公司提供的在線工具，設計一對shRNA序列的模版DNA和無關對照shRNA模版DNA。根據在線從CXCR4基因的mRNA序列中篩選1條shRNA靶序列，并合成相應的正義和反義DNA 鏈模板。以上模板DNA鏈寡核苷酸包括BamHI酶切位點、19nt正義序列、RNA PolⅢ終止子和HindⅢ酶切位點。同時設計好陰性對照模板，設計的siRNA序列在GenBank表達序列標簽(EST)數據庫中用BLAST檢索后排除與人體其他任何mRNA有同源性。對照組序列不針對人體任何mRNA 序列，確定序列的唯一性。

1.3合成DNA片段和雙鏈模板DNA:按照上面CXCR4-shRNA正反義鏈序列合成DNA片段。將合成片段分別溶于雙蒸水中，配制成100pmol/μl的溶液。每條正義鏈分別與其反義鏈退火后，形成一個限制性核酸內切酶BamHI和HindⅢ酶及黏性末端。12%非變性PAGE凝膠檢測雙鏈形成效率，凝膠成像儀檢測電泳條帶。

1.4CXCR4-shRNAR表達質粒載體的構建及鑒定:BamHI和HindⅢ酶切處理pSilencerTM 3.1-H1 neo表達質粒載體(AM5770; Vector Size: 4285 bp; 20rxns)，形成線性片段，除去酶切下來的小片段而純化，使其不發生自身連接。用T4 DNA連接酶將退火后的雙鏈核苷酸片段插入線性化載體。使用BamHI和HindⅢ酶切處理pSilencerTM 3.1-H1 neo表達質粒載體進行酶切消化。

1.5連接(克隆制備)和轉化:將退火形成雙鏈DNA與經BamHI和HindⅢ酶切的pSilencerTM 3.1-H1 neo載體連接。于4℃ 12h連接反應，制備克隆連接液，準備轉化。用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加2μl 連接液，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。將管放到預加溫到42℃的循環水浴中放好的試管架上90s。快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻l～2min。每管加800μl SOC培養基。用水浴將培養基加溫至37℃，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復蘇。將150μl已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/L MgSO4和Amp抗性的 SOB瓊脂培養基上。將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平皿，于37℃培養，16h。陽性克隆PCR鑒定后菌液送測序。選擇測序鑒定正確的克隆，將保存的正確的單克隆菌液接種于2～5ml抗性LB培養基中，37℃培養，按照實驗說明進行陽性克隆質粒抽提篩選。設轉染CXCR4-shRNA表達載體的細胞為實驗組，轉染無關對照shRNA載體的細胞為無關對照組。

1.6RT-PCR檢測CXCR4 mRNA表達:以人MV3細胞作為空對照，分別取實驗組、無關對照組和空白對照組細胞，按Trizol試劑說明書操作提取細胞總RNA，用于擴增人CXCR4 cDNA。PCR引物由上海申工合成。PCR擴增后行1%瓊脂糖凝膠電泳，用圖像掃描儀拍照并進行條帶灰度分析，以CXCR4與GAPDH的比值代表其相對含量。

1.7Western blot 檢測CXCR4蛋白的表達:取實驗組、無關對照組和空白對照組細胞，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，用BC試劑盒檢測蛋白質濃度。取PBS、各樣品10μl，加DW990μl;取DW勻漿緩沖液、樣品稀釋液、系列牛血清白蛋白標準濃度0.5ml;向各管加入2.5ml D試劑混勻，靜置10min;迅速加入酚試劑0.25ml，混勻37℃水浴30min;721分光光度計650nm，比色，SO標準管調零;最后稀釋為4μg/μl，加載樣緩沖液后終濃度2μg/μl，上樣量30～80μg/泳道。灌制10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣50μg，經電泳、轉膜、封閉后，依次與CXCR4抗體(1:200)及HRP標記的二抗(1:500)反應1h，化學發光試劑曝光顯影，紫外分光光度計掃描各條帶灰度植值以反映蛋白質的表達水平。內參照為β-actin。

1.8統計學處理:采集數據以均數±標準差表示，SPSS10.0統計軟件進行t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1shRNA載體質粒酶切鑒定與純化:pSilencerTM 3.1-H1 neo載體酶切反應物經瓊脂糖凝膠電泳證實，線性化后的質粒與未經酶切的質粒的電泳遷移率不同(圖1A)，線性化后的質粒泳遷移速率稍快于未經酶切的質粒。DNA雙鏈退火后經12%PAGE凝膠電泳，可見在3、4泳道形成條帶的與雙鏈對照泳道形成的條帶在同一水平線上(圖1B)。

2.2PCR鑒定重組質粒與陽性克隆質粒抽提:實驗組和無關對照組經PCR檢測均可見約320bp的條帶，與預測目的條帶大小相符，與之相對應的兩個空質粒均沒有條帶，說明插入序列均整合到載體上。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示圖中可見雙鏈、超螺旋質粒占絕大部分，說明質粒抽提質量高(圖2)。

2.3CXCR4-shRNA陽性克隆PCR鑒定:退火形成雙鏈DNA與經BamHI和HindⅢ酶切的pSilencerTM 3.1-H1 neo載體連接，連接產物轉化DH5α大腸桿菌，挑取重組陽性克隆，行PCR鑒定陽性克隆，重組細菌克隆的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳發現泳道4～9的PCR產物條帶電泳遷移率慢于泳道3即空載組的PCR產物條帶，說明泳道4～9均為插入片段陽性的克隆(圖3)。挑選陽性克隆CXCR4-shRNA菌液送測序。

2.4重組質粒序列測定:測序結果與目的序列完全相同，表明構建重組質粒成功。插入部分序列圖譜測序結果表明合成的CXCR4-shRNA寡核苷酸鏈序列插入正確(圖4)。

2.5shRNA對人轉移性黑色素瘤細胞MV3 內CXCR4 mRNA表達的影響

半定量RT-PCR DNA瓊脂糖凝膠電泳結果分析顯示，各組樣本均可見這亮度均一的GAPDH對照條帶，實驗組CXCR4目的DNA條帶亮度較空白對照組淺，無關對照組目的DNA條帶無明顯變化(圖5)。

CXCR4-shRNA穩定轉染MV3細胞后，CXCR4 mRNA的表達水平明顯低于空白對照組，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。實驗組、無關對照組和空白對照組中CXCR4 mRNA的表達水平分別為20.6%±5.1%、70.6%±2.6%和72.2%±3.9%。無關對照組與空白對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 shRNA對人轉移性黑色素瘤細胞MV3 內CXCR4蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，實驗組CXCR4-shRNA穩定轉染MV3細胞后，CXCR4蛋白的表達明顯被抑制(圖6)。實驗組、空白對照組和無關對照組中CXCR4蛋白的表達率分別為12.8%±2.3%、41.1%±1.9%和38.5%±2.7%。空白對照組和無關對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組較空白對照組其表達率顯著下降(P<0.01)。

3討論

CXCR4作為HIV入侵機體的協同受體，1996年由Feng等首先克隆出來[7]。以往研究表明，CXCR4與其特異配體SDF-1相互作用可以觸發細胞內多種信號傳導，從而介導細胞參與各種生理和病理過程如炎癥細胞的移行、造血干細胞的歸巢、血管生成、造血系統與淋巴系統的發育和成熟等[8-10]。

目前已有研究者利用RNA干擾技術針對CXCR4作腫瘤生物學特性的相關研究，并在抑制乳腺癌、結腸癌等的轉移中顯現出明顯的效果[11]，但CXCR4 shRNA能否抑制黑色素瘤侵襲和轉移尚未見報道。本實驗構建的CXCR4 shRNA載體將為其黑色素瘤侵襲和轉移中的作用奠定基礎。

近年來siRNAs代替反義核苷酸技術進行轉錄后基因沉默，已經迅速而廣泛地應用到基因功能、基因表達調控、藥物靶篩選、調控細胞行為等熱門領域，并為基因治療開辟了新的途徑[12]。RNAi最重要的臨床應用就是在基因治療領域，通過“敲除”一個或多個特異蛋白的表達來減慢或終止疾病的致病過程，達到治療的目的。雖然理論上對于不同的疾病RNAi均具有一定的效果，但截止到目前RNAi技術主要應用于癌癥和傳染病的治療方面[13]。

自然界中存在3種干涉mRNA的機制:反義RNA、核酶和RNAi[14]。siRNA 的優點在于:在抑制基因表達的效果上，雙鏈RNA對靶基因的抑制效果至少比單鏈反義RNA的抑制效果強2個數量級。事實上，反義RNA的基因抑制效果可能取決于它形成dsRNA的能力。相對于反義RNA和核酶技術，RNAi沉默效果基本不受RNA二級結構的影響。在體外得到siRNA后再導入細胞內有兩方面無法克服的缺點:siRNA進入細胞后容易被降解;進入細胞siRNA的數量不受控制。針對這種情況，出現了質粒、病毒類載體介導的siRNA體內表達。

shRNA通過載體導入細胞后，利用細胞內的酶切機制得到siRNA而最終發揮RNA干擾作用。shRNA最大的優勢是利用載體上的抗生素標記可以建立相對穩定的長期基因沉默細胞株，或者通過病毒插入基因組中從而得到穩定的基因沉默表達株。此外，載體上的抗生素篩選還可以排除未轉染的細胞，以避免混雜的未轉染細胞中的目標基因mRNA干擾后繼的定量檢測結果。shRNA質粒載體除了可以做長期基因沉默，還可重復使用[15]。

本實驗綜合體內表達shRNA設計原則，由專業人員在線設計，以確保設計的siRNA序列的有效性。本實驗采用質粒載體介導的shRNA轉染效率高，穩定性好，對細胞的和組織的毒副作用小，在細胞中持續長期抑制靶基因的表達，適合基因治療和長期研究。實驗結果表明，以CXCR4為靶向的shRNA質粒載體能夠有效下調CXCR4基因的表達，達到CXCR4基因沉默效應，為下一部分實驗奠定了基礎。

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[收稿日期]2010-05-10 [修回日期]2010-07-14

編輯/張惠娟