通過實(shí)驗(yàn)讓學(xué)生理解影響凝膠過濾層析的因素

在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，凝膠過濾層析，也稱分子篩層析、排阻層析，是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎(chǔ)的一種層析分離技術(shù)。筆者現(xiàn)將凝膠層析的用途及通過實(shí)驗(yàn)讓學(xué)生理解掌握影響凝膠過濾層析的兩種因素闡述如下。

一、凝膠層析的應(yīng)用廣泛

凝膠層析的應(yīng)用非常廣泛，最主要的應(yīng)用有以下四種。

1.脫鹽

高分子(如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等)溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析除去，這一操作稱之為脫鹽。

2.用于分離提純

凝膠層析已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。凝膠對熱原有較強(qiáng)吸附力，可用于除去無離子水中的致熱原制備注射用水。

3.測定高分物質(zhì)的分子量

用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析、記錄每一分鐘成分的洗膠體積;根據(jù)物質(zhì)的洗膠體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。

4.高分子溶液的濃縮

二、通過葡聚糖凝膠柱層析實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生理解影響凝膠過濾層析的兩種因素

學(xué)生通過實(shí)驗(yàn)，掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。對于凝膠過濾層析的理論學(xué)習(xí)，學(xué)生普遍感到抽象、難理解。通過實(shí)驗(yàn)，可以讓學(xué)生在實(shí)驗(yàn)的過程中，變抽象為直觀，變難懂為易懂。在實(shí)驗(yàn)開展的進(jìn)程中，學(xué)生可以親眼觀察到凝膠的選擇和層柱大小、長短的不同均會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.凝膠的選擇，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同型號的凝膠

目前，市售凝膠主要包括:價(jià)格便宜的凝膠葡聚糖G-10，分離范圍<700;價(jià)位適中的凝膠葡聚糖G-35，分離范圍是<5000;價(jià)格偏貴、膠位度較大的為凝膠葡聚糖G-35、G50，分離范圍分別為1000-17000及1000-30000。在該實(shí)驗(yàn)中，樣品藍(lán)色葡聚糖2000分子量的約為2×105，而溴酚藍(lán)分子量約為670，兩者分子量相差較大，可選擇顆粒較大而膠聯(lián)度較小的、價(jià)格相對適中的凝膠葡聚糖G25。由于藍(lán)色葡聚糖分子量過大，不能從凝膠分子中通過，所以藍(lán)色葡聚糖2000克于溴酚藍(lán)出柱，從而達(dá)到分離、兩者分離的效果。

在實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生可以清楚地認(rèn)識到:第一，選擇凝膠首先要根據(jù)樣品的情況確定一個(gè)適中的分離范圍，根據(jù)分離范圍來選擇合適型號的凝膠。如果分離范圍選擇過小，則某些組分不能得到分離;如果分離范圍選擇過大，則分離率較低，分離效果也不好。第二，選擇凝膠顆粒的太小。顆粒小，分辨率高，但相對的流速慢，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長，有時(shí)會造成擴(kuò)散現(xiàn)象嚴(yán)重;顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當(dāng)也可以得到滿意的結(jié)果。選擇時(shí)，要依據(jù)分離的具體情況而定。例如，樣品中各個(gè)組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，較快達(dá)到分離的目的;如果有個(gè)別組分差別較小，則要考慮使用小顆料凝膠以提高分辨率。

2.層析柱的大小、長短對分離結(jié)果的影響

在該實(shí)驗(yàn)中，樣品量較小，只有0.6ml的混合樣，柱粗可采用1CM，再采用兩根長短不同的層析柱進(jìn)行分離。對比兩者分離效果，層析柱1(1×20CM)，藍(lán)色葡凝糖2000和溴甲酚藍(lán)明顯在柱中分層，在540nm處吸光度檢查，分別在12管和26管出現(xiàn)峰值，說明兩者得到較好地分離。層析柱2(1×20CM):藍(lán)色葡聚糖2000和溴甲酚藍(lán)在柱中沒有出現(xiàn)明顯的分層，在540nm處吸光度檢查，在第8管和10管中出現(xiàn)相似的峰值，說明兩者出柱的時(shí)間較接近，難以分離。

另外，層析柱的長度對層析效果會產(chǎn)生直接影響。在實(shí)際的工作中，常常通過系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)來選擇規(guī)格適合的層析柱。為了滿足高分辨率的要求，通常采用L/D(長度/直徑)比值高的柱子。但是，增高柱長雖然能提高分辨率，但會影響流速和增加樣品的稀釋度。在該實(shí)驗(yàn)中，由于葡聚糖2000和溴甲酚藍(lán)分子量差別較大，一般認(rèn)為直徑與高度的比為1:20為宜，柱高以20cm為準(zhǔn)。該柱高不但滿足兩種樣品的分離，柱上能表現(xiàn)明顯的分層，且能縮短分離時(shí)間。

(作者單位:海南省高級技工學(xué)校)