原癌基因Fra-1在人乳腺腫瘤組織中表達的初步研究

摘要 目的：探討轉錄因子Fra-1在人乳腺良、惡性腫瘤組織中的表達及細胞內的定位。方法：采用免疫組織化學方法檢測良、惡性乳腺腫瘤組織Fra-1表達及細胞定位；并分析惡性乳腺腫瘤組織Fra-1表達與乳腺癌預后指標ER、PR和HER-2表達的相關性。結果：61例良、惡性腫瘤組織都存在Fra-1的細胞核表達。在20例良性腫瘤組織中，17例(85.0％)Fra-1主要定位于上皮細胞核內，3例(15.0％)可見Fra-1細胞核及細胞質共表達。而37例(90.2％)惡性腫瘤組織存在Fra-1細胞核和細胞質共表達，Fra-1在惡性腫瘤細胞質中的表達明顯高于良性腫瘤(P=0.000)。惡性腫瘤Fra-1細胞質表達與ER、PR和HER--2的表達無明顯相關性。結論：Fra-1蛋白的表達強度和方式與乳腺癌上皮細胞的癌變有關；它在乳腺癌細胞細胞質的滯留與乳腺癌的發生、發展具有一定的相關性。

關鍵詞 乳腺癌 Fra-1 轉錄因子 免疫組織化學

中圖分類號：R739.7

文獻標識碼：B

文章編號：1006－1533(2011)01－0044－04

目前已發現許多原癌基因編碼的產物為轉錄因子，它通過改變細胞的生長、分化、發育程序在細胞的癌變過程中發揮重要的作用。轉錄因子激活蛋白－1(AP-1)是許多信號轉導的中轉站，在接受外源刺激、調控靶基因的轉錄中發揮重要的作用。AP-1家族中的Jun-Jun同源二聚體或Fos-Jun異源二聚體能與靶基因啟動子上的TPA反應元件TRE結合，而TPA為一強致癌物，因此，AP-1復合物一經發現，就預示它與腫瘤發生、發展的潛在關系。

Fra-1為Fos家族中的一員，由于Fra-1沒有轉錄激

通訊作者：宋玉華。E-mail：qdsongyh＠163.com活區，早期的研究推測Fra-1可能參與AP-1的負向調控。然而，最近的證據表明，Fra-1在細胞的運動、侵襲以及維持轉化細胞的惡性表型方面具有重要的作用。研究顯示，在成纖維細胞中過表達Fra-1導致細胞貼壁非依賴性生長以及在裸鼠體內形成腫瘤。在多種腫瘤及腫瘤細胞系中發現Fra-1的高表達，提示Fra-1參與了腫瘤的惡性進展。本研究探討Fra-1在中國人乳腺腫瘤組織中的表達，并對它與乳腺癌發生、發展的關系進行分析。

1 對象和方法

1.1樣品收集

61例良、惡性乳腺組織標本石蠟切片收集自中國人民解放軍軍事醫學科學院附屬第307醫院。組織標本經10％福爾馬林固定，石蠟包埋。

1.2臨床及病理資料

61例臨床病例均為女性患者，年齡為31～72歲，中位年齡47歲。61例臨床標本中，良性20例(其中，乳腺纖維腺瘤10例，乳腺小葉增生伴腺病10例)；惡性41例(其中，浸潤性導管癌31例，浸潤性小葉癌4例，浸潤性導管小葉癌6例)。乳腺癌標本中，Ⅰ期6例，Ⅱ期24例，Ⅲ期8例，Ⅳ期3例。乳腺癌標本中雌激素受體陰性(ER-)22例，雌激素受體陽性(ER+)19例；孕激素受體陰性(PR-)24例，孕激素受體陽性(PR+)17例；表皮生長因子受體低表達(HER2-或HER2+)25例，表皮生長因子受體過表達(HER2++或HER2+++)16例。

1.3免疫組織化學分析

Fra-1兔多克隆抗體購自美國Abeam公司。采用sP三步法免疫組織化學染色，SP免疫組織化學染色試劑盒為ZYMED公司產品，按sP試劑盒說明書操作。EDTA緩沖液熱抗原修復，DAB顯色，蘇木精襯染，以PBS及非特異性人免疫球蛋白Ig代替Fra-1作為陰性對照。

1.4結果判定

根據細胞核染色結果將核陽性分為高表達(≥75％細胞陽性)和低表達(<75％細胞陽性)；根據細胞質的染色結果將細胞質陽性分為高表達(強染色)和低表達(弱染色)；陰性為細胞核或細胞質不染色。通過光學顯微鏡400倍放大對組織切片細胞核和細胞質陽性細胞數進行計數。

1.5統計學分析

采用Fisher’s精確檢驗比較各參數間的差異，P<0.05為有顯著性差異，使用SPSS13.0統計軟件進行分析。

2 結果

2.1 Fra-1在良、惡性乳腺腫瘤組織中的表達

在所有乳腺腫瘤組織標本中，均存在Fra-1在細胞核內表達。分別以PBS及非特異性人Ig取代抗Fra-1抗體作為陰性對照，未檢測到良、惡性腫瘤組織細胞核及細胞質的表達，表明該抗體的特異性。Fra-I在良、惡性乳腺腫瘤組織中的表達見表1。

2.2 Fra-1在良性乳腺腫瘤組織中的表達

在85％(17／20)的良性腫瘤組織中，Fra-1主要定位于上皮細胞核內，炎性細胞為陰性，但并非所有的上皮細胞均存在Fra-1核染色。乳腺纖維腺瘤的染色結果顯示，在導管上皮細胞中，Fra-1染色大多出現于腔面上皮層的頂端，腺泡基底膜鄰近的肌上皮層為陰性。小葉基底細胞可見弱的細胞核染色。多數病例(17／20，85％)中，Fra-1僅表達于細胞核，3例(3／20，15％)標本可見細胞核及細胞質Fra-1染色均為陽性。

2.3Fra-1在惡性乳腺組織中的表達

與乳腺纖維腺瘤和乳腺小葉增生伴腺病相比，所有不同組織類型的乳腺癌標本均存在Fra-1核染色強陽性(100％細胞核或≥75％細胞核染色陽性)。在約90％的乳腺癌標本中可見到不同程度的細胞質染色，盡管細胞質的染色強度弱于細胞核。在腫瘤細胞附近的周圍正常組織很少見到Fra-1在細胞質中的表達，在正常的上皮組織僅可見基底細胞層存在Fra-1的細胞核表達。在56％(23／41)的乳腺癌組織觀察到Fra-1的細胞質弱表達，34％(14／41)存在強的細胞質和細胞核共同染色。

2.4同一腫瘤組織中Era-1的表達

對同一張組織切片不同視野乳腺腫瘤組織Fra-l表達水平進行比較，發現癌旁正常組織中，Fra-1表達呈弱陽性，其表達僅定位于細胞核內，在分化差的腫瘤組織中，Era-1同時表達于細胞核和細胞質，而且Fra-1表達可見于所有的癌細胞。

2.5良、惡性乳腺腫瘤組織Fra-1細胞質表達的差別

良性乳腺組織20例，其中3例存在細胞質的弱表達，陽性率為15％。惡性乳腺組織41例，其中23例細胞質弱表達，14例細胞質高表達，僅有4例細胞質為陰性，陽性率為90.2％。良、惡性組織細胞質表達率存在顯著性差異(P=0.000)，見表2。

2.6惡性乳腺腫瘤組織Fra-1細胞質表達與EK、PR及HER2的關系

乳腺癌組織中，ER(-)22例，ER(+)19例；PR(-)24例，PR(+)17例；表皮生長因子受體HER2低表達23例，HER2過表達18例。未觀察到Fra-1細胞質表達與ER、PR及HER2的相關性。結果見表3。

3 討論

在多種人類惡性腫瘤及腫瘤細胞系中可檢測到AP-l活性的升高，Fra-1在細胞的惡性轉化及惡性腫瘤的發生過程中可能起到關鍵作用。有研究發現，Fra-1與乳腺癌細胞系的高侵襲力有關，在過表達Fra-1的MCF-7細胞，Fra-1可誘導基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶1(MMP-1)、血管內皮生長因子(VEGF)和細胞周期素Dl(cyctinDl)的表達，還有研究表明，Fra-1可誘導骨橋蛋白、血小板反應素和CD44的表達，提示Fra-1可能影響細胞的增生、侵襲和血管生成。有人應用基因芯片技術，研究了Fra-1對4種高侵襲性乳腺癌細胞系和9種低侵襲性乳腺癌細胞系的運動和侵襲的影響，結果發現，24種表達不同的基因中，Fra-1在高侵襲性的乳腺癌細胞中表達明顯增高。同樣，用基因芯片技術檢測22種人類乳腺癌上皮細胞株／系及來源于原發性乳腺癌、轉移性乳腺癌、乳房減少成形術的細胞，獲得相似的結果。因此有關研究人員認為，Fra-1可能是乳腺癌的一個有價值的診斷標志。

Philips等應用Northern blot檢測不同乳腺癌細胞系Fra-1 mRNA的表達，發現ER(-)乳腺癌細胞Fra-1表達明顯高于ER(+)細胞，未發現Fos家族其它成員和Jun蛋白在不同ER狀態細胞間表達的差別。ER㈠腫瘤細胞生長速度快，在裸鼠中易形成轉移瘤。Bamberger等用Western blot檢測了乳腺癌組織AP-1家族成員各蛋白的表達，發現FosB與ER(+)、分化好的腫瘤表型相關，Fra-1表達與乳腺癌的臨床分期、組織類型和HER2表達狀態無關，但與組織分級(高分級，G3)有關，與ER狀態負相關。為了進一步驗證Fra-1在人乳腺癌組織中表達的意義，筆者用免疫組織化學方法檢測了Fra-1在良、惡性乳腺腫瘤中的表達，分析了Fra-1表達與乳腺癌預后指標ER、PR和HER2的關系。結果顯示，所有瘤組織(包括良、惡性腫瘤)都存在Fra-1細胞核表達，而腫瘤周圍的正常組織中，僅有上皮細胞存在弱的Fra-1細胞核表達。在良性腫瘤中，Era-1表達主要定位于細胞核，20例纖維腺瘤和小葉增生伴腺病患者中只有3例呈現細胞核表達伴細胞質弱表達。但在不同組織類型的乳腺癌中可見Era-1細胞核和細胞質的共表達，約90％的癌組織Fra-1表現為細胞核和細胞質共表達。然而，受免疫組化學方法靈敏度限制，尚不能檢測出Fra-1細胞質表達輕度增加。雖然Era-1表達不能成為乳腺癌有價值的診斷指標，但Fra-1蛋白的表達強度及方式與上皮細胞的癌變有關。

已有報道，在乳腺癌細胞中Fra-1表達與ER表達存在負相關性，也有人發現，在乳腺癌組織Fra-1表達與ER狀態相關。但是ER(-)細胞中，Fra-1高表達與磷酸化可能僅發生于培養條件下，因為無論在ER(－)和ER(+)的臨床惡性腫瘤組織樣本中，通過Western blot均未檢測到磷酸化Fra-1蛋白的表達。另有研究顯示，Fra-1表達與PR的異構體PR-B有負相關性。本研究未發現Fra-1表達與ER、PR及HER2的相關性，因此目前尚很難判斷Fra-1是否能成為一個有價值的預后指標。

Fra-1缺乏轉錄激活區，推測Fra-1與c-Jun形成二聚體調控基因的表達。有研究發現，Era-1過表達啟動了腫瘤惡性進展相關基因的轉錄及誘導上皮細胞間質化(EMT)。EMT存在腫瘤的進展過程中，腫瘤細胞EMT可使之獲得較強的侵襲及轉移能力。最近，有研究發現，Fra-1在肺上皮細胞的異常分化及轉化過程中發揮一定的作用。但是，Fra-1在腫瘤發生中的確切作用仍不明確。許多轉錄因子穿梭于細胞核和細胞質之間，Fra-1的合成始于細胞質，然后進入核內與靶基因的DNA序列結合。當Fra-1過度表達時，可能存在Era-1的核輸入受阻，從而導致細胞質內Fra-1蛋白水平增高。Era-1在細胞質的滯留可能在乳腺癌的發生過程中起一定的作用。新近的研究發現，核蛋白p21Cipl／WAF1可轉移到細胞質，當發生p21Cipl／WAFl轉移時，各種凋亡信號不再能誘導細胞凋亡。對于乳腺癌細胞中Era-1細胞質高表達的非轉錄機制尚需進一步的研究。