不同配比納米羥基磷灰石/聚己內酯復合材料細胞相容性的研究

[摘要]目的：觀察不同配比nPCL/HA電紡纖維取向薄膜材料的細胞相容性。方法：將人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）體外誘導培養為成骨細胞；并經傳代培養第5代的人骨髓間充質干細胞，以2×105cm2的密度與不同配比nPCL/HA電紡纖維取向薄膜支架在培養板內共培養，同時以nPCL電紡纖維非取向薄膜材料作為對照，初步觀察hBMSCs在不同配比nPCL/HA支架材料上復合培養，對其細胞相容性進行評價。結果：hBMSCs與3種電紡薄膜支架材料均有細胞相容性，細胞能在不同材料表面黏附生長、分化增殖。但是PCL/ HA的配比為20:1電紡纖維取向薄膜材料黏附率（35.3±2.6）%，為3中材料中黏附率最高的一種，材料表面細胞生長良好，體積變大，有偽足生長。結論：PCL/ HA的配比為20：1電紡纖維取向薄膜材料，較適合作為支架材料應用于hBMSCs為種子細胞的組織工程構建。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；聚己內酯；羥基磷灰石；細胞相容性

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）02-0243-04

Cellular biocompatibility of various electrospunnPCL/HA scaffold materials

LI Jia-feng1，WAN Mei-rong2，GUAN Hai-hong1，HE Wen-peng1，ZHANG Hong-chuang1，ZHANG Yang1，CHEN Li-juan1

(1.Department of Oral Maxillofacial Surgery， Affiliated Xuzhou City Hospital of Xuzhou Medical College; 2.Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，Jiangsu，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate cellular biocompatibilityof different nPCL/HA scaffold materials.MethodsElectrostatic spinning or electrospinning is an interesting method for producing nonwoven fibers with diameters of submicrometers down to nanometers. Nanofibrous membranes were used in many biomedical applications including drug delivery， wound healing and scaffolding for tissue engineering. Novel bone-scaffolding materials were successfully fabricated by electrospinning from polycaprolactone(PCL) solutions containing nanoparticles of hydroxyapatite(HA). In intro cultured hBMSCs(5th generation) were seeded at the density of 2×105 cell/cm2 onto scaffolds ofnPCL/HA and nPCL as control. The cell-material complex was observed in order to evaluate the cellular biocompatibilitybetween cells and materials.ResultsHBMSCs were shown good adhesion to all 3 types of scaffolds after seeding. The cellular biocompatibilityof nPCL/HA(20:1) (35.3±2.6)% washigher than the others.ConclusionNano-PCL/HA(20:1) was shown significantly higher adhesion rate to hBMSCs， and could be used as scaffold material in the field of bone tissue engineering.

Key words:bone marrow stromal cells; polycaprolactone; hydroxypatite; cellular biocompatibility

納米羥基磷灰石/聚己內酯復合材料是由豬骨提取的羥基磷灰石和聚己內酯交聯法獲得的。羥基磷灰石是骨組織的成分，納米級羥基磷灰石（Nano-HA）除了具有傳統HA的特性外，在理化性質和生物學方面有更大的優點[1-2]。聚己內酯（PCL）是一種被廣泛研究的可生物降解高分子材料，具有良好的生物相容性，且藥物通透性好。目前已在很多領域得到應用，尤其是在醫療方面，如膠帶、繃帶、矯正器、縫合線、藥物緩釋劑以及組織工程支架材料等。作為一種新復合材料，我們對其生物相容性進行評定，本文主要是評價該復合材料在體外的細胞相容性。

1材料和方法

1.1 實驗試劑和材料 試劑：MSCM（SCICELL），低糖DMEM/ F12（Hgclone，USA），胎牛血清（杭州四季清），淋巴細胞分離液（上海，比重為1.073g/ml），堿性成纖維細胞生長因子bFGF(promege)，人表皮生長因子EGF(promege)，RT-PCR試劑盒（北京天根生物有限公司），倒置顯微鏡（日本），二氧化碳培養箱，離心機。nPCL/HA電紡納米纖維（東南大學生物電子學國家重點實驗室提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：本文所用材料nPCL/HA電紡取向薄膜由由東南大學生物電子學國家重點實驗室提供，共有3種，分別是：1號樣品含HA比例為PCL:HA是5:1、2號樣品含HA比例為10:1、3號樣品含HA比例為20:1的乙酸乙酯溶液的電紡取向薄膜；4號樣品為一種不含HA的PCL的乙酸乙酯溶液的電紡纖維非取向薄膜作為對照。納米電紡薄膜的直徑約為1～5μm，材料規格約10cm×6cm大小，環氧乙烷消毒后備用。使用時制備成5mm×5mm。

1.2.2 人BMSCs的分離與培養：實驗所用肝素化的骨髓，來源于研究人員自身骨髓。20ml骨髓血與等量PBS混合，1500rpm、離心10min，棄脂肪和上清層。用PBS重懸細胞，以3:1體積比加入Percoll(1.073g/ml)液面上，3 000rpm、離心25min。取單個核細胞層，用PBS洗遍2次，第三遍用含10%胎牛血清的DMEM/F12洗，接種于MSCM培養基培養瓶，置于37℃、5%CO2箱常規培養。72h后更換新鮮培養液，去除未貼壁細胞，以后每隔3天更換一次培養液。形成多個細胞克隆，傳代培養，傳至第5代(P5)細胞待用。

1.2.3hMSCs向成骨細胞分化的誘導 ：取P5代的MSCs，再更換為誘導液：用含10-7mol/L地塞米松 10-2mol/Lβ-甘油酸鈉500μg/L的維生素C的培養液來培養，觀察細胞形態變化。

1.2.4流式細胞儀：分別取誘導前P5代細胞和誘導后72h的細胞，0.25%胰酶消化后收集細胞，分別加入FITC標記的小鼠抗人CD34、CD45抗體，常溫暗室孵育20min，加入PBS 2ml，2 500r/min離心5min，棄上清，加入PBS 500μl混勻后用流式細胞儀檢測。

1.2.5RT-PCR：分別取誘導前P5代細胞和誘導后72h的細胞，0.25%胰酶消化后收集細胞，做RT-PCR，以高純度離心柱試劑盒提取總RNA。PCR反應體系為25ul體系，40個循環。引物序列分別為：Ⅰ型膠原蛋白(534bp)：上游5＇-GGTTTGGAGAGAGCATGACC-3＇，下游5＇-TTTGGGGAAATTGA GTTTGG-3＇。擴增產物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統照相。

1.2.7復合材料復合細胞培養和粘附實驗：本實驗將nPCL/HA納米電紡取向薄膜制備成5mm×5mm大小，環氧乙烷消毒后置于24孔培養板，將傳至第5代的人骨髓間充質干細胞以2×105/cm2的密度接種于材料上，靜態2h后再加1ml培養基，于37℃、5%CO2培養箱常規培養，培養24h、48h、72h，用倒置顯微鏡（40×100倍）觀察細胞生長及黏附情況。黏附率的測定采用間接計數法計算，具體方法為：將材料取出，用胰酶消化細胞，胎牛血清終止反應，PBS輕輕沖洗，收集細胞；另行將培養板殘余細胞消化收集，分別計數，所得結果為未黏附細胞數。材料的細胞黏附率=（總細胞數－未黏附細胞數）/總細胞數×100%。

2結果

2.1 倒置顯微鏡下觀察：骨髓間充質干細胞分離接種24h后細胞呈半貼壁狀態，扁平（圖1A），48h后完全貼壁，有“出芽現象”（圖1B），72h后細胞呈紡鍾狀，有偽足生長，加入新鮮培養基后，細胞逐漸形成梭形。7天后細胞逐漸形成集落（圖1C），由15～20個細胞融合成，細胞排列有一定的方向性，呈漩渦狀排列，象成纖維細胞，培養14天細胞融合80%～100%傳代擴增，24h細胞完全貼壁，此時細胞增殖較旺盛，每周擴增一次，共計五次。加入誘導劑培養72h后細胞細胞由單一的纖維狀變成立方形三角形多邊形，體積增大，細胞表面分泌出顆粒狀物質，增殖細胞之間界限模糊，局部細胞可呈復層生長，與成骨細胞有相似的形態和生長特點，最終形成骨結節（圖1D）。

2.2nPCL/HA材料的掃描電鏡檢測細胞培養的形態學觀察：（見圖2）；纖維薄膜呈取向性。

2.3 HBMSCs在材料表面生長分化：HBMSCs接種培養于不同配比的電紡薄膜表面后，采用倒置顯微鏡（40×100倍）下觀察細胞在電紡薄膜表面的黏附情況，并據此測算其黏附率。培養24h后，可見不同材料表面黏附細胞數量不一，細胞形態不一。48h后，見不同材料人骨髓基質干細胞緊貼薄膜表面，細胞開始變形，大小形態不一，交錯明顯，細胞無偽足生長。72h后，3號材料細胞黏附，大小不一，部分細胞偽足生長不明顯，部分細胞偽足生長明顯，有個別細胞未有偽足生長（圖3A）。2號材料MSCs細胞黏附，未見有明顯偽足伸展，大小不一。有個別孔隙內細胞黏附，偽足伸展（圖3B）。1號材料MSCs細胞生長分布均勻，黏附表面，細胞有偽足生長明顯。見細胞形態不一（圖3C）。

2.4 3種不同材料的黏附率分別為：28.8%±2.5%，24.8%±2.3%，35.3%±2.6%，對照材料49.9%±2.3%。表1中可見，在3號電紡纖維取向薄膜材料的黏附率最高，且與nPCL電紡纖維非取向薄膜材料的黏附率相近，2號電紡纖維取向薄膜材料的黏附率最低。

2.4 RT-PCR結果：圖像分析結果表明，MSCs的I型膠原mRNA的表達很弱，細胞定向誘導后，I型膠原mRNA的表達明顯增強，如圖4。

2.5流式細胞儀：hMSCs表型鑒定結果:P1骨髓干細胞CD34、CD45熒光強度為9.97和16.10；P5 CD34、CD45熒光強度分別為144.79和237.55 (圖5)。

3討論

細胞培養法檢測材料細胞相容性是一種快速、簡便、有效廉價的方法，在材料生物相容性評價中有至關重要的作用。復合材料與細胞在體外培養可以消除體內多種因素的干擾，直接觀察細胞在材料表面的粘附、生長和分化增殖情況。研究認為不同組織來源的細胞對材料的敏感度是有差異的[3]。我們用以實驗的組織工程材料是骨組織修復材料，因此需選用骨髓來源地細胞或者具備能誘導轉化為骨的細胞作為種子細胞，如骨髓間充質干細胞。骨髓間充質干細胞具有多向轉化的潛能，通過生長因子的誘導，最終能分化為成骨細胞，在骨缺損的修復過程中起著重要作用，是當前最適骨組織工程的種子細胞[4]。MSCs在骨髓中的含量并不高，我們通過流式細胞儀檢測CD34、CD45的表達很低，經過梯度離心和貼壁培養，P1熒光強度分別為9.97和16.10，經傳代、純化CD34、CD45的表達明顯升高，P5熒光強度分別為144.79和237.55，說明在較短時間內可以獲得大量種子細胞。另外，分泌Ⅰ型膠原是骨細胞的特征之一，用RT-PCR方法可檢測誘導后72h的Ⅰ型膠原mRNA的表達比誘導前明顯升高，從分子水平上說明骨髓間充質干細胞可以向成骨細胞分化。研究表明細胞在材料表面的粘附有多種因素，其中主要有材料表面的粗糙程度、表面修飾、改性和材料的方向性等[5]。Baier等人認為材料表面的特性和自由能決定細胞的生物你粘附性，動物實驗表明低表面能材料粘附的細胞呈球形或者橢圓形，粘附作用極弱；高表面能材料被細胞覆蓋，粘附的細胞呈扁平，有偽足生長且伸長的形態，粘附作用較強。結果表明高表面能材料表面更有利于細胞粘附生長。另外，合成生物材料表面的理化結構，對細胞的粘附和生長起到重要作用。研究認為[6-7]，材料表面結構不同有不同的生物特性，比如羥基、酰胺基等，有利于細胞的生長粘附。

在本研究中，nPCL/HA電紡薄膜復合材料直徑約為1～5μm，同時以單純納米級PCL非取向電紡纖維薄膜材料作為實驗對照，組織工程支架材料加入納米級羥基磷灰石晶體顆粒，通過選擇適當加工參數，能夠調控支架材料的孔隙率、厚度、三維結構（縱橫交錯或者有取向性）、降解率和動力學性能等。聚己內酯（PCL）是通過己內酯的開環聚合得到的屬于人工合成的脂肪族聚酯，是一種半結晶型聚合物，其結構重復單元上有5個非極性亞甲基和一個極性酯基，使得其具有很好的柔韌性和加工性，同時具有很好的生物相容性[8-9]。該研究中三種實驗材料，聚己內酯與羥基磷灰石的配比不同，分別為5:1、10:1、20:1，這樣材料的表面結構和理化性質，表面能是不同的，研究通過與細胞的粘附，證明何種配比的材料能達到最佳的生長粘附、增殖分化。本實驗中，細胞與材料復合培養24h后，可見不同材料表面黏附細胞數量不一，細胞形態不一。48h后，見不同材料人骨髓基質干細胞緊貼薄膜表面，細胞開始變形，大小形態不一，交錯明顯，細胞無偽足生長。72h后，材料之間細胞粘附的差異開始明顯，有的材料細胞黏附形態大小不一，細胞偽足生長不明顯；有的細胞偽足生長明顯，有個別細胞未有偽足生長，個別孔隙內細胞黏附數量較多。說明細胞在材料表面生長、粘附、分化與其表面結構有密切關系。復合支架材料保持很高的孔徑和孔隙率，有利于營養物質的供應，材料中的納米HA與骨組織中的羥基磷灰石類似。我們實驗中的人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）是我們研究人員志愿者捐獻，通過分離傳代培養獲得的經檢測證實細胞純度高、性能穩定、增殖能力強。倒置顯微鏡觀察，hBMSCs不僅可以在材料表面黏附，而且纖維愈細，孔隙率愈高，生長黏附愈好，與文獻中報告相一致。本研究觀察到細胞黏附與纖維的方向性（取向性）一致，即無取向電紡纖維薄膜上細胞呈雜亂生長，而取向電紡纖維薄膜上細胞呈取向性生長，也就是說取向性誘導了細胞的取向生長，并且能夠短時間內變大，伸展，有偽足生長并向周圍鋪展。以往研究僅表明nPCL電紡纖維薄膜上細胞的相容性好，細胞能較好的黏附、生長和繁殖，而本研究結果表明，不同配比的nPCL/HA電紡纖維取向薄膜也是一種較好的骨組織工程支架材料，適合應用于hBMSCs作為種子細胞的組織構建，尤其3號電紡纖維取向薄膜材料的黏附率與單純nPCL電紡纖維非取向薄膜的黏附率最接近。通常來說，表面粗糙的材料，細胞黏附能力優于表面光滑材料[10]。nPCL/HA大體外觀光滑均勻，纖維直徑1～5μm，與細胞外基質天然結構相似，同時纖維支架材料中引入的不同比率HA納米粒子，對材料進行改性，使其表面積大，纖維均一，孔隙率高，有利于氧氣和營養物質的供應、細胞的黏附、生長和分化。實驗結構表明：3種材料表面的細胞黏附率有較差異性，材料的配比不同，纖維粗細不同，所取得材料物化性質和表面結構存在差異，細胞所需的氧氣和營養物質穿透纖維薄膜通過率不同，從而使得細胞黏附率不同。

本實驗表明，3號電紡取向薄膜，具有較高的孔隙率、良好的物化性質和細胞相容性，有利于種子細胞黏附生長，比另外兩種材料更適合骨組織工程構建。

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[收稿日期]2010-10-22 [修回日期]2011-01-11

編輯/張惠娟