黃芪甲苷對紫外線誘導皮膚成纖維細胞表達TGFβRⅡ與Smad7的影響

[摘要]目的：探討黃芪甲苷對紫外線誘導皮膚成纖維細胞TGFβRⅡ、Smad7mRNA以及蛋白質表達的影響。方法：培養原代人皮膚成纖維細胞，UVA及UVB分別照射人成纖維細胞，黃芪甲苷進行干預，MTT法檢測細胞增殖活性，以ELISA 法檢測Smad7的生成量，半定量RT-PCR法檢測TGFβRⅡ、Smad7 的mRNA表達，Western blot法檢測TGFβRⅡ的蛋白表達。結果：不同濃度的黃芪甲苷干預組與正常對照組相比，成纖維細胞增殖活性隨濃度增加而增強，藥物濃度為40μg/ml時最顯著（P<0.05）；UV輻射組與正常組相比，細胞上清液中Smad7蛋白含量明顯增高，細胞內TGFβRⅡ的mRNA和蛋白表達均下降， Smad7mRNA表達增強；黃芪甲苷干預后，細胞上清液中Smad7蛋白含量下降，細胞內TGFβRⅡ的mRNA以及蛋白表達水平明顯增高，Smad7mRNA表達下降（P<0.05）。結論：黃芪甲苷可能通過提高成纖維細胞的增殖活性，上調TGFβRⅡmRNA、蛋白水平以及下調Smad7 mRNA、蛋白水平的表達來對抗紫外線抑制TGF-β/Smad信號通路的傳導，緩解皮膚光老化進程。

關鍵詞：黃芪甲苷；人成纖維細胞；TGFβRⅡ；Smad7

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）02-0225-04

Effect of Astragaloside on TGFβRⅡ and Smad7 expression in human skin fibroblasts induced by Ultraviolet

YAN Ning1，CHEN Bin1，LI Ran1，LI Shuang-feng1，BI Zhi-gang，ZHANG Yin-di2

(1.Department of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China;

2.Institute of Clinical Pharmacology，Nanjing Medical Vniversity)

Abstract:ObjectiveTo investigate effect of Astragaloside on the expression of TGFβRⅡ，Smad7 mRNA and protein in human skin fibroblast induced by Ultraviolet.MethodsCultured human skin fibroblasts were treated with different concentrations of Astragaloside. Cellular activity was detected by MTT assay. The secretions of Smad7 in cultured fibroblasts were detected by enzvme -linked immunoadsordent assay (ELISA). The mRNA levels of Smad7 and TGFβRⅡwere determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The protein levels of TGF-βRⅡ was measured by Western blot assay.ResultsCompared with the control group， the increase of cell proliferation was observed followed the dosages-increased intervention of Astragaloside(P<0.05). The secretions and the mRNA expression of Smad7 were obviously increased， the protein expression and the mRNA levels of TGFβRⅡ was markedly decreased after UV irradiation comparing with the control group. After treated with Astragaloside， the secretions and mRNA expression of Smad7 were both decreased， the protein and the mRNA expression of TGFβRⅡwere both increased(P<0.05).ConclusionAstragaloside treatment may relieve the UV- damaged in the fibroblasts through elevating the cell proliferation activity and regulating the expression of related molecules in the TGF-β/Smad signaling pathway.

Key words: Astragaloside;human skin fibroblasts;TβR-Ⅱ;Smad7

紫外線(Ultraviolet，UV)引起的皮膚光老化最為重要的外觀特征是皺紋形成，在組織學上主要表現為膠原成分減少和彈性纖維變性沉積等皮膚基質構成的改變。而紫外線輻射誘導真皮Ⅰ型膠原減少是皮膚光老化中皺紋形成的首要原因[1]。

TGF-β/Smad信號轉導途徑具有促進成纖維細胞增生以及細胞外基質成分合成的作用。TaiHao Quan等研究表明，紫外線輻射可改變TGF-β的跨膜信號傳導，不僅可通過改變TGF-β的基因表達水平和下調TGFβRⅡ的水平直接影響TGF-β/Smads信號轉導路徑的信號傳遞，還可通過誘導機體內Smad7、AP-1、CYR61等信號分子的產生或活化而間接阻斷TGF-β/Smads信號通路的信號轉導， 從而影響成纖維細胞對膠原蛋白等細胞外基質蛋白的合成和分泌[2-3]。

中藥提取物預防皮膚光老化的研究已有不少報道。 黃芪是我國常用的中藥之一，具有抗氧化、抗炎等多方面藥理作用。黃芪甲苷 (Astragaloside，As)為黃芪皂甙類單體成分，是黃芪的主要有效成分，在抗衰老抗氧化方面，有其獨特的作用[4]。本實驗以人原代成纖維細胞作為研究對象，UV輻射后，以黃芪甲苷直接作用于成纖維細胞，觀察其對紫外線誘導皮膚成纖維細胞TGFβRⅡ、Smad7表達的影響，為黃芪甲苷抗皮膚光老化作用提供理論依據和實驗基礎。

1材料和方法

1.1 材料與試劑：SUV-100日光紫外線模擬器（上海SIGMA公司），128C型酶標儀（奧地利Clinibio公司），DMEM培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），ELISA試劑盒（武漢優爾生科技股份有限公司），Trizol（美國Invitrogen公司），RT-PCR引物（上海英駿技術服務有限公司合成）， RT-PCR反應體系（大連寶生物有限公司），凝膠成像掃描系統分析儀（意大利Bio-Rad公司），一抗兔抗人TGFβRⅡ（millipore公司）、二抗羊抗兔（sant cruz公司），垂直電泳儀購、ECL 發光劑（美國 GE 公司），BCA試劑盒（碧云天公司），柯達活體成像儀 cymentre2000（美國 Kodak 公司），黃芪甲苷（江蘇省中科學院植物研究所）。

1.2 原代人成纖維細胞培養：取健康兒童環切包皮，利用細胞培養法，加入含20%小牛血清的DMEM培養液，待成纖維細胞融合至80%～90%時消化傳代，實驗選用3～8代細胞。

1.3 藥物的配置：取0.05g黃芪甲苷干粉溶于0.5ml二甲基亞砜 ( DMSO)， 配成濃度為100mg/ml的貯存液，-20℃保存，臨用時用DMEM 培養液倍比稀釋，使其終濃度分別為3、5、10、20、30、40、45、50μg/ml。

1.4 MTT法測細胞增殖活性及藥物最適濃度：制備單細胞懸液，接種于96孔板中，等細胞貼壁生長至70%～80%時，加入不同濃度的黃芪甲苷，培養24h后換回無藥物的培養基， 再向每孔(含100μl培養基)加入20μl濃度為5mg/ml的 MTT，孵育 4h，棄上清，加入150μl DMSO，置恒溫振蕩器內振蕩10min，酶標儀測定各孔在490nm處吸光值(A值)，計算細胞活性以及選取最佳藥物濃度。每種藥物濃度4個復孔，重復3次試驗。

1.5紫外線照射及實驗分組：將細胞接種在直徑10cm的培養皿中，用含10%FBS的DMEM培養液于37℃、5%CO2溫箱孵育，待細胞生長至80%～90%時進行實驗。實驗分5組，A組 (正常對照組)：未經任何處理； B組（UVA照射組）；C組（UVB照射組）；D組（As+UVA組）：用黃芪甲苷孵育2h，棄去，PBS洗1次，再以UVA照射，照射后繼續以含黃芪甲苷的DMEM培養；E組（As+UVB組）：用黃芪甲苷孵育2h，棄去，PBS洗1次，再以UVB照射，照射后繼續以含黃芪甲苷的DMEM培養；以上加藥組均以濃度為40μg/ml（經MTT所測得藥物最適濃度）的黃芪甲苷處理，B組、D組以10J/cm2的UVA照射，C組、E組以30mJ/cm2的UVB照射，照光后各組均加入相應的無血清DMEM培養基繼續培養24h后，收集細胞上清液用于ELISA，細胞用做RT-PCR及Western blot。

1.6 ELISA法檢測細胞上清Smad7分泌量：加入黃芪甲苷干預24h后，收集上清液。嚴格按照試劑說明書進行。

1.7 半定量RT-PCR測定細胞TGFβRⅡ和Smad7mRNA表達變化：細胞總RNA提取嚴格按trizol提取液說明書進行，按照相應的PCR試劑盒逆轉錄合成cDNA；按以下引物進行RT-PCR擴增：

Smad7引物（301bp）

F-primer 5' -CCT CCT TAC TCC AGA TAC CCA -3'

R-primer 5' -GCT GAC TCT TGT TGT CCG AAT -3'TGFβRⅡ引物（81bp）

F-primer 5'-CTG CGT CTG GAC CCT ACT CTG T-3'

R-primer5'-TTC TGG AGC CAT GTA TCT TGC A-3'

β-actin做內參照引物（271bp）

F-primer 5'-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC-3'

R-primer 5'-CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC-3'

擴增條件：預變性94℃5min； 變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，循環35次；最后72℃7min延伸。最后取 PCR產物l0μl在2%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外凝膠成像系統掃描成像。

1.8 Western blot檢測TGFβRⅡ的蛋白水平：于照光加藥后24h收集各實驗組細胞，以M- PERTM (Pierce)蛋白提取液分別處理細胞，收集細胞總蛋白，BCA法定量后經 SDS-PAGE，電轉膜，免疫抗體反應，最后化學增強發光法(ECL)顯帶。

1.9 統計學處理：數據以（x±s）表示，用SPSS13.0統計軟件對實驗數據進行單因素方差分析，P<0.05有顯著性差異。

2結果

2.1 黃芪甲苷對成纖維細胞增殖活性的影響：不同濃度黃芪甲苷干預后，結果顯示：細胞活性隨黃芪甲苷的濃度增加而增強，與正常對照組相比，藥物濃度為40μg/ml時差異最顯著（P﹤0.05），見圖1。

2.2 黃芪甲苷對成纖維細胞細胞上清液中Smad7含量的影響：表1結果顯示：UV照射組Smad7蛋白含量明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P﹤0.05），黃芪甲苷處理后，Smad7蛋白含量明顯下降，與UV照射組相比差異顯著（P﹤0.05）。（表1）。

2.3 黃芪甲苷對成纖維細胞TGFβRⅡ、Smad7mRNA表達的影響：結果如表2所示： UV組，TGFβRⅡmRNA相對表達量明顯低于正常對照組，而Smad7 mRNA的相對表達量明顯增高，與正常組相比有顯著性差異（P﹤0.05）， 黃芪甲苷處理后， 細胞TGFβRⅡmRNA的相對表達量升高， Smad7mRNA的相對表達量明顯降低，與UV組相比差異有統計學意義（P﹥0.05）（表2、圖2、圖3）。

2.4 黃芪甲苷對成纖維細胞TGFβRⅡ蛋白表達的影響：如圖4b所示，UVA（10J/cm2）及UVB（30J/cm2）輻射的成纖維細胞（設為D組及E組）與正常培養的細胞相比，其TGFβRⅡ/β-actin比值降低，加入黃芪甲苷后TGFβRⅡ/β-actin比值增高，分別為D組的1.66倍，為E組的1.67倍，且與相應的UV組相比差異均有顯著性（P<0.05）。見圖4。

3討論

成纖維細胞是真皮的主要功能細胞和結構基礎，也是紫外線輻射的重要靶位之一， 經UV輻射后，不僅可使成纖維細胞的增殖活性降低，還可使細胞內一系列的信號傳導出現異常，膠原蛋白合成減少，最終導致皮膚光老化。

轉化生長因子-β（TGF-β）是一多功能的細胞生長調節蛋白。TGF-β可促進成纖維細胞增殖，使其合成膠原等細胞外基質成分的能力增強[5]。TGF-β超家族受體主要有Ⅰ型（ TGFβRⅠ）和Ⅱ型（TGFβRⅡ），都屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶跨膜受體。TGF-β的Ⅱ型受體（TGFβRⅡ）與TGF-β的Ⅰ型受體（TβRI）形成異源受體復合物一起介導TGF-β在細胞內的信號轉導[6]。Smad蛋白被認為是介導TGF-β信號進入細胞核內的最重要的信號分子；Smad家族中Smad7對TGF-β/Smads途經的信號轉導起負性調節作用[7]。TaiHao Quan等研究表明，UV 輻射成纖維細胞可下調TGFβRⅡ，影響對TGF-β的效應能力，干擾TGF-β依賴的I型前膠原基因表達以及蛋白的合成[2-8]，并能誘導Smad7在皮膚內表達，阻礙TGF-β/Smad信號傳導通路，在皮膚成纖維細胞中TGF-β/Smad信號傳導通路受阻，導致I 型前膠原合成減少，造成膠原喪失[2，9]。本實驗亦證實紫外線輻射能引起成纖維細胞TGFβRⅡmRNA及蛋白表達下降，對于Smad7，UV照射同樣可引起其mRNA及蛋白表達升高。本實驗結果與國外報道一致。

黃芪甲苷為一種黃芪皂苷類單體成分，是黃芪制劑中的主要有效成分。王曦等[10]發現黃芪甲苷在較低濃度時可促進皮膚成纖維細胞增殖以及成纖維細胞I型膠原蛋白表達。本實驗結果顯示，不同濃度黃芪甲苷組與對照組相比，成纖維細胞的增殖活性均有所升高，并具有劑量依賴性，且藥物濃度在40?g/ml時作用最明顯，亦證實黃芪甲苷能夠促進成纖維細胞增殖。近幾年來還有報道，黃芪甲苷對紫外線輻射具有保護作用。 陳斌等[11]研究發現黃芪甲苷可通過促進皮膚角質形成細胞增殖以及減少細胞凋亡來減輕UVB輻射的損傷。王玫玲等[12]報道黃芪甲苷可顯著抑制 UVA對成纖維細胞的氧化損傷，并能增強細胞的抗氧化防御能力。但黃芪甲苷能否通過激活TGF-β/Smad信號途徑對抗紫外線輻射所致的皮膚光老化，至今尚無報道。本研究發現，紫外線輻射能引起成纖維細胞TGFβRⅡmRNA及蛋白表達下降，引起Smad7 mRNA及蛋白表達升高；而加入黃芪甲苷干預處理后，成纖維細胞TGFβRⅡmRNA和蛋白表達水平均增高， Smad7mRNA及蛋白表達水平均下降。由此結果，我們推測黃芪甲苷可能通過上調TGFβRⅡ以及下調Smad7的表達來對抗UV抑制TGF-β/Smad信號通路的傳導， 從而促進成纖維細胞合成膠原蛋白。

黃芪甲苷作為一種植物活性成分， 可以通過多種途徑抑制紫外線對皮膚的損傷。本實驗研究結果表明，黃芪甲苷能顯著抑制UV對體外培養的人成纖維細胞的光損傷，這一效應同黃芪甲苷促進成纖維細胞增殖和調節TGF-β/Smad信號傳導密切相關。

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[收稿日期]2010-10-20 [修回日期]2011-01-06

編輯/張惠娟