基質(zhì)金屬蛋白酶-12及其組織抑制物-1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

[摘要]目的：檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-12(MMP-12)及其組織抑制物-1（TIMP-1）在皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC）中的表達(dá)并探討其與腫瘤分化、淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：免疫組化法檢測(cè)MMP-12及TIMP-1在20例正常皮膚組織和32例鮑溫病（BD）、53例SCC患者皮損中的表達(dá)。結(jié)果：在正常人皮膚和BD患者皮損中，MMP-12不表達(dá)，TIMP-1呈弱陽性表達(dá)，而兩者在皮膚SCC患者皮損中均呈彌漫表達(dá)，MMP-12在SCC患者瘤組織中表達(dá)陽性率為92.4%，在低分化組或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)明顯高于高分化組（P＝0.009）或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＝0.01）；TIMP-1在SCC患者皮損中表達(dá)陽性率為84.9%，在高分化組或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)明顯高于低分化組（P＝0.005）或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＝0.01）。結(jié)論：MMP-12、TIMP-1蛋白的表達(dá)可能與SCC的癌分化和轉(zhuǎn)移有關(guān)，MMP-12高表達(dá)與TIMP-1低表達(dá)提示SCC腫瘤細(xì)胞可能有較高的侵襲潛能。

[關(guān)鍵詞]鱗狀細(xì)胞癌；Bowen病；巨噬細(xì)胞金屬彈力酶；金屬蛋白酶類組織抑制劑

[中圖分類號(hào)]R739.5[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2011）02-0237-03

Expression of matrix metalloproteinase-12 and its tissue inhibitor-1 in cutaneous squamous cell carcinoma

XUAN Min1，2，YANG Hui-lan1，F(xiàn)AN Jian-yong1，LIANG Jie1，ZHANG Ling1

(1.Department of Dermotology，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010，Guangdong，China；2.Graduate School of Nanfang Medical University，Guangzhou 510015，Guangdong，China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of matrix metalloproteinase-12（MMP-12）and its tissue inhibitor-1（TIMP-1）in cutaneous squamous cell carcinoma（SCC）and the relationship between the expression and tumor differentiation and lymph node metastasis.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expression of MMP-12 and TIMP-1 proteins on the paraffin embedded sections of 53 patients with SCC and 32 patients with BD.ResultsMMP-12 and TIMP-1 proteins were diffusely expressed in the tumor nets and mesenchymal cells around the nets，while in normal epidermis and BD MMP-12 was negative，and TIMP-1 was weakly positive. The expressive rate of MMP-12 was 92.4％，and the expression in poorly differentiated tumous or with lymph node metastasis was significantly higher than that in highly differentiated ones（P＝0.009）or without lymph node metastasis （P＝0.01）. The expressive rate of TIMP-1 was 84.9％，and the expression in highly differentiated tumous or without lymph node metastasis was significantly higher than that in poorly differentiated ones（P＝0.005）or with lymph node metastasis （P＝0.01）.ConclusionsThe expression level of MMP-12 and TIMP-1 protein correlates with the differentiation of carcinoma and lymph node metastasis.The higher expression of MMP-12 and lower expression of TIMP-1 may indicate a higher risk of the tumor invasion and metastasis.

Key words:squamous cell carcinoma；bowen's disease；macrophagemetalloelastase；tissue inhibitor of metalloproteinase

Bowen病（bowen disease BD）和皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Squamous cell carcinoma，SCC）均系起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的惡性腫瘤。前者為原位癌，病變局限于表皮內(nèi)，基底膜帶是完整的。后者為侵襲性癌，癌組織突破基底膜帶并侵入真皮。腫瘤細(xì)胞周圍細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的破壞是腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）及其組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）在此起重要作用，其中MMP-12（又稱巨噬細(xì)胞金屬彈力酶，macrophage metalloelastase，MME）通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞基底膜，從而促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。TIMP-1特異性地與MMP-12結(jié)合，抑制其活性[1]。目前有關(guān)MMP-12與皮膚SCC的關(guān)系少見報(bào)道，本研究應(yīng)用envision免疫組化法檢測(cè)32例BD、53例SCC皮膚組織中MMP-12及TIMP-1的表達(dá)，探討其與皮膚SCC浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1材料和方法

1.1 病例資料：選取我院2000～2010年間的鮑溫病及皮膚鱗癌手術(shù)切除標(biāo)本共85例，均經(jīng)組織病理證實(shí)。其中BD患者32例，年齡43～85歲，平均61.25歲，男18例，女14例；皮損位于頭頸部10例，四肢8例，軀干5例，外生殖器9例。SCC患者53例，年齡28～86歲，平均63.19歲，男30例，女23例；皮損位于頭頸部20例，四肢14例，軀干6例，外生殖器13例；其中伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移著23例。高分化20例，中分化15例，低分化18例。另取我院皮膚科及外科手術(shù)切除正常皮膚20例作為對(duì)照。

1.2 試劑：鼠抗人多克隆抗體MMP-12、鼠抗人單克隆抗體TIMP-1及Envision試劑盒均購自廣州萊德爾公司。

1.3 方法：采用envision二步法進(jìn)行免疫組化分析。石蠟切片常規(guī)處理后，依次加入適當(dāng)稀釋的一抗（MMP-12、TIMP-1的工作濃度為1:100）、envision二抗，DAB顯色、蘇木素復(fù)染。并用已知陽性片作陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：MMP-12與TIMP-1以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒狀物質(zhì)為陽性，并按著色強(qiáng)弱分級(jí)：無著色為0，淺黃色為1，深黃色為2，棕黃色為3。著色范圍為在10×40高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞），計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞所占的百分比均值：＜25%為1，25～50％為2，≥50%為3。上述兩項(xiàng)相加為MMP-12或TIMP-1的表達(dá)強(qiáng)度積分：＜2為陰性（－），＜3為弱陽性（＋），3～4為陽性（＋＋），＞4為強(qiáng)陽性（＋＋＋）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS10.0軟件包對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1 MMP-12與TIMP-1表達(dá)分布：MMP-12在正常對(duì)照表皮中無表達(dá)，在真皮成纖維樣細(xì)胞中呈弱陽性表達(dá)或無表達(dá)。BD中MMP-12只有2例弱陽性表達(dá)，主要集中在成纖維樣細(xì)胞及巨噬樣細(xì)胞。53例SCC患者中陽性表達(dá)49例（92.4%）；表達(dá)較弱者均勻分布于癌巢中，較強(qiáng)者常以癌巢中心為著，癌巢周圍間質(zhì)中部分巨噬樣細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞亦有陽性表達(dá)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中陽性表達(dá)強(qiáng)度與原發(fā)灶相似。

TIMP-1在正常對(duì)照表皮中呈弱陽性表達(dá)，主要表達(dá)于顆粒層和棘細(xì)胞層，真皮層中成纖維樣細(xì)胞、單一核細(xì)胞可見陽性染色。32例BD表皮全層均有TIMP-1表達(dá)，以顆粒層和棘細(xì)胞層為主，真皮層中成纖維樣細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、單一核細(xì)胞等可見陽性染色。53例SCC患者中TIMP-1陽性表達(dá)45例（84.9%），其在高分化鱗癌的癌巢中央表達(dá)較強(qiáng)，而在低分化者中呈彌漫性分布，癌旁間質(zhì)中梭形纖維樣細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等部分見陽性染色。如圖1～4。

2.2 MMP-12、TIMP-1表達(dá)與鱗癌分化及轉(zhuǎn)移的關(guān)系：MMP-12蛋白的表達(dá)在SCC組高于BD組，而TIMP-1蛋白在兩組之間的表達(dá)則相反，MMP-12蛋白在低分化鱗癌或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)明顯高于高分化或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，TIMP-1蛋白在高分化鱗癌或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)明顯高于低分化或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（表1）。

3討論

腫瘤細(xì)胞周圍細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜（BM）的破壞是癌細(xì)胞發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。MMPs是一組高度依賴鋅離子的蛋白水解酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分，破壞局部組織結(jié)構(gòu)、增加腫瘤誘導(dǎo)的血管形成，故其在腫瘤發(fā)展和侵襲的各個(gè)階段均起重要作用[2]。TIMP是MMP表達(dá)的最重要調(diào)節(jié)因子，具有抗血管形成及調(diào)節(jié)MMP活性的作用，從而抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移。在正常情況下，MMP和TIMP在體內(nèi)保持相對(duì)平衡狀態(tài)，惡性腫瘤組織中，MMPs高表達(dá)程度往往高于TIMP，趨向有利于ECM降解，且失去可調(diào)控性。MMP-12是MMPs家族中的一員，又稱巨噬細(xì)胞金屬彈性酶（HME），由活化的巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌，能夠降解多種細(xì)胞外及非細(xì)胞外成分，彈性蛋白是其主要底物，一方面它通過分解纖溶酶原和Ⅴ型、Ⅹ Ⅲ型膠原，產(chǎn)生血管抑素和內(nèi)抑素，抑制血管生成，抑制腫瘤的生長和侵襲[3]，另一方面，它還能分解細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分，如Ⅳ型膠原和纖維蛋白，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[4]，故MMP-12被認(rèn)為在腫瘤發(fā)展上起雙向作用。

本研究結(jié)果顯示，正常皮膚幾乎不表達(dá)MMP-12蛋白，只在真皮淺層部分梭狀細(xì)胞呈弱表達(dá)。個(gè)別BD病表達(dá)MMP-12亦是在巨噬細(xì)胞中偶見，而非腫瘤細(xì)胞。在SCC中MMP-12主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，其次表達(dá)于巨噬細(xì)胞及成纖維樣細(xì)胞，并且表達(dá)MMP-12的巨噬細(xì)胞主要分布于癌巢邊緣，這與Erja[5]等報(bào)道的研究結(jié)果相似。MMP-12在低分化鱗癌中的表達(dá)明顯高于高分化者（P=0.009），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P=0.01）。結(jié)果提示低分化鱗癌可產(chǎn)生較多的MMP-12來降解細(xì)胞外基質(zhì)，有助于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。TIMP-1作為MMP-12蛋白表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，可選擇性地與MMP-12形成復(fù)合物，抑制其水解活性。本研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1在低分化鱗癌中的表達(dá)低于于高分化者（P=0.005），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P=0.01），提示TIMP-1表達(dá)隨鱗癌分化程度降低而減少，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)強(qiáng)度較弱。MMP-12及TIMP-1伴隨腫瘤分化程度和有無轉(zhuǎn)移呈反方向變化，說明雖然兩者在腫瘤組織中表達(dá)均增多，但MMP-12較其抑制因子表達(dá)的更多，顯示出蛋白酶的優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，導(dǎo)致兩者比例失衡，腫瘤向著侵襲轉(zhuǎn)移的方向發(fā)展。

已有研究表明部分MMPs，如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9等與皮膚鱗癌局部侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[6]，MMP-12能夠誘導(dǎo)MMP-2、 MMP-3、MMP-9表達(dá)[7]，引起 MMP-12水解的較為復(fù)雜的瀑布式級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)。目前已證實(shí)MMP-1、MMP-9的轉(zhuǎn)錄需要啟動(dòng)子激活蛋白AP-1的誘導(dǎo)方可進(jìn)行，而AP-1恰恰是MMP-12啟動(dòng)子區(qū)的重要結(jié)構(gòu)[8]，說明MMP-12可能為以上多種MMPs激活的前驅(qū)因子。另外在日光性皮膚損傷的變性彈性纖維中，隨著紫外線強(qiáng)度的增加[9]，MMP-12表達(dá)上調(diào)，同時(shí)促進(jìn)變性物質(zhì)的積累，增加其破壞作用，提示MMP-12與皮膚光老化形成機(jī)制密切相關(guān)，這可能亦是日光性損傷導(dǎo)致BD病和皮膚鱗癌發(fā)病的重要因素之一[10]。

綜上所述，MMP-12、TIMP-1與皮膚SCC組織分化程度和浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MMP-12的高表達(dá)及其與TIMP-1比例失衡，可能是早期判斷皮膚鱗癌轉(zhuǎn)移和侵襲性的一個(gè)有價(jià)值的指標(biāo)，但MMP-12激活調(diào)節(jié)其他MMPs活性的作用機(jī)理，及與SCC患者預(yù)后的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Dumas V，Kanitakis J，Charvat S，et al. Expression of basement membrane antigens and matrix metalloproteinases 2 and 9 in cutaneous basaland squamous cell carcinomas[J].Anticancer Res，1999，19(4B):2929-2938.

[2]Kerkela E， Alaaho R， Lohi J，et al.Differential patterns of stromelysin-2 (MMP-10) and MT1-MMP (MMP-14) expression in epithelial skin cancers[J]. Br J Cancer，2001，84:659-669.

[3]Egeblad M，Werb Z.New functions for the matrixmetalloproteinases in cancer progression [J].Nat Rev Cancer，2002，2(3):161-174.

[4]Bradbury PA，Zhai R，Hopkins J.Matrix metalloproteinase 1，3 and 12 polymorphisms and esophageal adenocarcinoma risk and prognosis[J]. Carcinogenesis，2009，30(5):793-798.

[5]Kerkely E，Alaaho R，Jeskanen L，et al.Expression of human macrophage metalloelastase (MMP12) by tumor cells in skin cancer[J].J Invest Dermatol，2000，114(6):1113-1119.

[6]馬澤粦，樊翌明.皮膚鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)及其與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊(cè)，2004，30(3):176-177.

[7]Lanone S，Zheng T，Zhu Z，et al.Overlapping and enzymespecific contributions of matrix metalloproteinases 9 and 12 in IL-13 induced inflammation and remodeling[J].J Clin Invest，2002，110(4):463.

[8]Yu Y，Chiba Y，Sakai H，et al . Possible involvements of nuclear factor-kappa B and activator protein-1 in the tumor necrosis factor-alpha-induced upregulation of matrix metalloproteinase-12 in human alveolar epithelial A549 cell line[J]. J Pharmacol Sci，2010，112(1):83-88.

[9]Mizobe Y，Oikawa D，Tsuyama S，et al. mRNA expression of lysyl oxidase and matrix metalloproteinase-12 in mouseskin[J].Biosci Biotechnol Biochem，2008，72(11):3067-3070.

[10]Chung JH，Seo JY，Lee MK，et al. Ultraviolet modulation of human macrophage metalloelastase in human skin in vivo[J].J Invest Dermatol，2002，119(2):507-512.

[收稿日期]2010-10-18 [修回日期]2010-12-29

編輯/張惠娟