牙髓干細胞研究進展

干細胞是一類具有自我更新、高度增生能力和多相分化潛能的細胞，能夠產生高度分化的功能細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞。目前，已在體外成功地擴增出人體多種組織的成體干細胞，自從2000年Gronthos等[1]發現人牙髓組織中存在成體干細胞即牙髓干細胞( dental pulp stem cells，DPSCs)后 ，近十年來國內外學者對牙髓干細胞的培養、生物學特性、細胞表型、分化能力及重組為誘導性多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等方面已進行了大量研究，本文就牙髓干細胞的研究現狀綜述如下。

1 DPSCs的發現和生物學特性

牙髓是結締組織，位于牙齒髓室和根管內，有一定修復再生的能力。由于成牙本質細胞是一種終末細胞，一旦分化后就不再分裂，因此普遍認為在成牙本質細胞遭受損傷后，牙髓內存在的未分化前體細胞可分化為成牙本質細胞，并分泌細胞基質。但直到2000年，Gronthos等[1]才首次正式提出DPSCs的概念，把具有克隆形成能力的高增殖率的牙髓細胞命名為DPSCs，在試驗中應用酶消化法對成人第三磨牙牙髓細胞進行體外培養，并與骨髓基質干細胞( bone marrow stromal cells， BMSCs)進行比較，結果表明，這兩種細胞具有相似的免疫表型，但DPSCs具有更高的克隆形成率和增生率，經體外誘導后能形成分散而高密度的鈣化小結，當將DPSCs與HA /TCP支架共同培養后回植到小鼠背側皮下，能觀察到類似牙本-牙髓復合體樣的結構。Miura等[2]發現人脫落乳牙(stem cells from human exfoliated deciduous teeth， SHED)的牙髓中含有多能干細胞，具有高度增殖和克隆形成的特性，當將體外擴增的DPSCs 和SHED 與羥磷灰石/磷酸三鈣(hydroxyapatite/tricalcium phosphate， HA/TCP)聯合植入免疫缺陷小鼠的皮下時可形成牙本質- 牙髓樣結構。Young等[3]分離豬第三磨牙牙胚，制備單細胞懸液，并接種到可降解的聚合物支架上，植入大鼠腸系膜內生長20～30周，可成功地構建出牙齒結構，包括含成熟牙釉質的釉器官、牙本質、成牙本質細胞、髓室、上皮根鞘和成牙骨質細胞，證實了在豬第三磨牙有上皮和間充質干細胞的存在。

DPSCs 在形態上類似人骨髓成纖維細胞集落形成單位（colony forming unit fibroblast，CFU-F）[1]，大多數細胞呈長梭形，體積較小。透射電鏡下，DPSCs 的核呈卵圓形，約占胞體體積的80%～90%，核仁大而明顯，常染色質居中，異染色質少，分布于核周。胞漿很少，核漿比例大。細胞器較少，核糖體豐富，這些形態特征也體現了DPSCs的未分化或低分化狀態。自我更新是干細胞的重要特性， Gronthos等[4]從3個月的原代DPSCs移植物中分離出基質樣細胞，在體外培養擴增后植于小鼠皮下，結果形成牙本質-牙髓復合體樣結構。對形成的牙本質樣結構進行免疫組化檢測， 發現其牙本質涎蛋白(dentin sialo protein，DSP)表達陽性，證實DPSCs具有自我更新能力。多向分化能力也是干細胞的特征之一，在不同的微環境下，DPSCs 可分化為多種細胞，礦化誘導培養基中，DPSCs能夠形成與前期牙本質相似的球狀礦化基質并表達成牙本質細胞特異性標志牙本質涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）[5]；在脂肪誘導培養基中，DPSCs培養物中出現油紅“O”陽性的脂滴，并伴隨脂肪細胞特異性的pparγ2 和lpl基因表達上調；此外，DPSCs 還在mRNA 和蛋白水平表達神經前體細胞和神經膠質細胞的標志：神經巢蛋白（ nestin）和神經膠質纖維酸性蛋白（ glial fibrillary acid protein，GFAP），這說明體外培養的DPSCs有向神經樣細胞分化的潛能[5]。其他學者也成功地誘導了DPSCs 向成牙本質細胞、肌管樣細胞以及脂肪細胞的分化[6-7]。

2 DPSCs的定位、分離和鑒定

Gronthos等[1]推測DPSCs可能來源于血管周圍的微環境(perivascular niche)。Shi等[8]研究發現，DPSCs和BMSCs存在于它們起源組織的微血管周圍。Tecles等[6]選取拔除的根尖孔未形成的第三磨牙分為三組：一組制備累及牙本質的淺洞，一組制備暴露牙髓的深洞，一組不做處理，分別觀察牙髓內干細胞的活化和遷移，結果表明血管周圍存在干細胞。干細胞表面的分子標記是鑒定和研究干細胞功能的重要手段，目前發現明確的干細胞標記不多，對DPSCs的標記物研究也不夠深入。Gronthos等[1]應用免疫組化技術研究DPSCs的表面分子標記，并與BMSCs比較。結果表明，均表達與內皮細胞(血管細胞粘附分子1、CD146)、平滑肌細胞(α2平滑肌肌動蛋白)、骨細胞(堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、骨連接素、骨橋素、骨鈣素)和成纖維細胞(Ⅲ型膠原、成纖維細胞生長因子2)有關的分子標記。DPSCs不表達骨基質蛋白、骨涎蛋白，而在BMSCs為低水平表達。用Northern blotting方法研究發現DPSCs不表達成牙本質細胞的特異性標記物牙本質涎磷蛋白( dentin sialophosphop rotein， DSPP)，說明DPSCs處于未分化狀態，尚未分化為成熟的成牙本質細胞。為進一步比較DPSCs和BMSCs的性質，Shi等[7]應用基因芯片技術研究DPSCs和BMSCs的基因表達情況，發現兩者在人類將近4 400個基因表達水平上是一致的，包括表達細胞外基質成分、細胞粘附分子、生長因子、轉錄調節因子等的基因。但同時發現，DPSCs較高表達ⅩⅤⅢα1型膠原、胰島素樣生長因子2、盤狀結構域酪氨酸激酶、NAD ( P) H2維生素K3氧化還原酶、周期素依賴性蛋白激酶6等；BMSCs較高表達胰島素樣生長因子連接蛋白27和Ⅰα2型膠原。Liu等[9]研究發現，DPSCs分化時，初始Runx2、TGFβ相關基因、膠原代謝相關基因上調、堿性磷酸酶活性上升，后均下降；而細胞外基質磷糖蛋白(matrix extracellular phosphoglyco protein， MEPE)是DPSCs分化過程中唯一下降的標記物，作者認為MEPE是礦化的抑制劑，在DPSCs分化時下調，可作為DPSCs分化時的檢測指標。最近Mokry 等[10]研究表明，牙髓干細胞表達STRO-1、vimentin、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等間充質干細胞的細胞標志物，同時表達Sox2， nestin及 nucleostemin干細胞標志物。

3DPSCs的多向分化能力與相關因素的調控

牙髓干細胞是來源于神經嵴和間充質的多潛能干細胞[11]，研究發現其細胞群主要是來源于神經嵴細胞群，細胞標志物為low affinity nerve growth factor receptor (LANGFR)和間葉細胞群，標志物為1-integrin receptor subunit。這兩個細胞群都具有多向分化的功能。牙髓干細胞的多項分化能力即可塑性(plasticity)在國內外的很多實驗中得到驗證。Yu等[12]認為牙髓干細胞的分化方向取決于局部的微環境，他們在試驗中發現利用豬牙胚細胞條件培養基能誘導牙髓干細胞形成更加合理組織學結構的牙本質-牙髓復合體。Iohara等[13]研究發現，BMP2能夠刺激牙髓細胞分化為表達牙本質涎磷蛋白DSPP的成牙本質細胞。Saito等[14]也發現，BMP2能促進牛和人單層培養和三維膠丸培養的牙髓細胞分化為成牙本質細胞。Keklikoglu等[15]認為轉化因子AP21家族的成員FosB在成牙本質細胞和牙髓未分化間充質細胞的分化和增生方面有重要作用。Moioli等[16]的研究，TGF2β能誘導DPSCs向成牙本質細胞分化。Liu等[17]研究表明牙本質素是MEPE的一個肽片段，它能下調P16，促進DPSCs的增生，在牙髓修復中扮演重要角色。Gronthos等[1]發現DPSCs在含有L2抗壞血酸22磷酸、地塞米松、無機磷酸鹽的礦化誘導液培養基中培養5～6周后，經染色表明有鈣結節形成。Yamada 等[18]的研究表明，人DPSCs高表達DMP1，而DMP1在未分化間充質細胞分化和牙本質礦化中起重要作用。Arthur 等[19]體內和體外實驗中，分別加入了各種生長因子如EGF及FGF等，均發現牙髓干細胞可以分化為具有功能活性的神經元。Francesca Paino等[20]認為黑素細胞和牙髓細胞均源于神經嵴細胞群，在試驗中DPSCs在沒有外加定向誘導因素下，表達TRP-2、TRP-1、gp100/Pmel and MART-1抗原，且能自主分化為完全成熟的黑素細胞。Demarco 等[21]最近研究把三維多聚乳酸支架置于拔除的第三磨牙髓室內，用晶體鹽或膠體做成孔劑輔料，把牙髓干細胞接種于其內，發現與牙本質相關的形態發生因子在誘導牙髓干細胞向成牙本質細胞的分化中起著重要的作用，且DPSCs的微環境對細胞的行為和分化也有重要的影響。Jing WANG等[22]用納米纖維多聚乳酸支架進行DPSCs體內體外定向分化研究，發現BMP-7 和 DXM復合因子及納米纖維多聚乳酸支架可大大提高DPSCs向牙髓牙本質復合體的定向分化能力。Gronthos等[23]實驗成功對DPSCs進行了脂肪誘導，而Norsat等[24]證明DPSCs具有神經分化分化能力。

4DPSCs向 iPSCs 的重組轉化

誘導多潛能性干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是通過在分化的體細胞中表達特定的轉錄因子，以誘導體細胞的重編程而獲得的可不斷自我更新且具有多向分化潛能的細胞。由于iPSCs既避免免疫排斥，又不涉及倫理道德問題，因此具有廣泛且重要的臨床應用價值。在2006年日本學者Takahashi和Yamanaka[25]研究小組采用體外基因轉染技術， 從24個因子中篩選出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4個轉錄因子， 通過逆轉錄病毒將上述4個轉錄因子導入胚胎小鼠成纖維細胞或成年小鼠尾部皮膚成纖維細胞， 在小鼠ES細胞的培養條件下獲得了Fbx15+的多潛能干細胞系， 該細胞系在細胞形態、生長特性、表面標志物、形成畸胎瘤等方面與小鼠ES細胞非常相似， 而在基因表達譜、DNA甲基化方式及形成嵌合體動物方面卻不同于小鼠ES細胞， 故將其命名為iPSCs，從那開始全世界眾多實驗室開始了iPSCs研究[26-28]，相繼從狗、豬、猴和人等哺乳動物的皮膚細胞、肝細胞、羊水細胞、CD34血細胞、骨髓干細胞及牙齒干細胞等成體細胞成功獲得了iPSCs。其中牙髓組織在臨床上易于獲得，不牽涉倫理問題而得到廣泛關注。Tamaoki[29]和Xing YAN等[30]研究小組利用病毒載體把c-Myc、Klf4、 Oct4、 Sox2 和Lin28、Nanog、Oct 4、 Sox2因子導入牙髓干細胞中，成功獲得了iPSCs。

迄今為止，關于DPSCs的研究，國內外學者做了大量的工作，取得了很大的進展。但是DPSCs的研究仍面臨許多問題，如DPSCs有無特異性細胞標志物? DPSCs的鑒定標準? DSPCs的潛在分化能力和如何定向誘導DPSCs的分化? Telomere在DPSCs體外培養和體內增殖過程中的作用機制？DPSCs向 iPSCs的成功轉化載體和重組因子的優化？這些問題說明DPSCs應用于臨床還有很長的路要走，需要相關學者更多的基礎和臨床研究。

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[收稿日期]2010-11-29 [修回日期]2011-02-10

編輯/李陽利