血清微環境對小鼠T細胞衰老的調節作用

[摘要]目的：探討血清微環境對小鼠T細胞衰老的調節作用。方法：分別取年老（12～14月齡）及年輕（1.5～2月齡）小鼠各10只，提取其脾臟淋巴細胞及血清，實驗分4組。組I為年老鼠T淋巴細胞+10%年輕鼠血清；組II為年老鼠T淋巴細胞+10%年老鼠血清；組III為年輕鼠T淋巴細胞+10%年輕鼠血清；組IV為年輕鼠T淋巴細胞+10%年老鼠血清。培養48h后，經流式細胞術研究CD8+CD28+共表達率差異。結果：組I和組II T細胞表面的CD8+CD28+共表達率分別是（10.84±0.6841）%和（3.18±0.1789）%，組III和組IV T細胞表面的CD8+CD28+共表達分別是（12.5±0.9445）%和（8.36±0.2074）%。各組間對比有統計學差異（P<0.05）結論：血清微環境具有調節小鼠T細胞衰老的作用，年輕鼠血清能使年老鼠的T細胞表面的CD8+CD28+共表達率提高，年老鼠的血清能使年輕鼠的T細胞表面的CD8+CD28+共表達率降低。

[關鍵詞]血清微環境；T淋巴細胞；免疫衰老；流式細胞術

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）06-0946-03

Effects of serum microenvironment on CD8+CD28+T cell

(SHI Bing-bing1，ZHANG Lei1，ZHOU Bi-yu2，CAO Yi-mei2，GAO Feng2，YIN Ning-bei2，YAN Li1， ZHAO Zhen-ming2

（1.Research center，2.The First Department， Plastic Surgery Hospital，Chinese Academic Medical Science and Peking Union Medical College，Beijing 100144，China)

Abstract： ObjectiveTo observe the effects of serum microenvironment on CD8+CD28+T cells. MethodsMouse lymphocytes were isolated from spleen，these cells from young mouse and old mouse were cultured under the following serum microenvironment. All mouse were divided into four groups: the lymphocytes from old mouse cultured with young serum (group I);the lymphocytes from old mouse cultured with old serum (group II)，the lymphocytes from young mouse cultured with young serum (group III)，and the lymphocytes from young mouse cultured with old serum (group IV).The co-expression of CD8+CD28+ on T cells was detected by the flow cytometry.ResultsIn the group of lymphocytes from old mouse cultured with young serum， the co-expression of CD8+CD28+ was （10.84±0.6841）%. In the group of lymphocytes from old mouse cultured with old serum group.The co-expression of CD8+CD28+ was （3.18±0.1789）%. In the group of lymphocytes from young mouse cultured with young serum and cultured with old serum group，the co-expression of CD8+CD28+ were （12.5±0.9445 ）%and （8.36±0.2074）% ， respectively. There were significant statistical differences in these four groups.ConclusionOur study revealed that young serum could improve the co-expression of CD8+CD28+ on T cells. So the senescence of T cells can be regulated by serum.

Key words:serum microenvironment；T lymphocytes；immunosenescence；flow cytometry

衰老導致的皮膚及容顏的改變是整形美容外科的難題，其本質是隨著年齡增長而出現的緩慢進行的生物體細胞、組織、器官形態結構和功能的退行性變化。而免疫衰老又是機體衰老的重要機制之一，它參與了機體其他系統衰老的發生過程。免疫衰老的機制尚不完全清楚，部分學者認為免疫衰老與胸腺退化導致的T細胞衰老有關。而T細胞衰老的一項重要指標是CD8+CD28+ 共表達率降低[1]。

血清微環境，廣泛參與細胞之間的相互作用，調節細胞的功能[2]。有學者研究表明血清中含有能夠調控細胞衰老的相關因素，這其中包括：細胞外基質成分，氧張力，生長因子，細胞因子，以及血清的pH值、離子濃度（如鈣離子濃度）等。甚至代謝產物如精氨酸酶也起作用[3]。目前少有血清微環境對小鼠T細胞衰老的調節作用的研究[4-5]，本實驗旨在研究血清微環境對T細胞表面的CD8+CD28+共表達的影響情況，從而探討血清微環境對免疫老化的調節作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：C57BL/6N小鼠（購自北京維通利華公司），年老組：12～14月齡，10只（相當于人類生理年齡40～50歲），雌性， 體重30g。年輕組：1.5～2月齡，10只（相當于人類生理年齡15～20歲），雌性， 體重20g。以上動物均為SPF級。

1.2 儀器、試劑：CO2細胞培養孵箱（日本Hirasawa Works 公司）、Biofuge離心機（德國Heraeus公司）、Transwell培養皿（美國corning公司）、FACS Aria流式細胞儀（美國BD公司）、小鼠淋巴分離液（中國醫學科學院生物工程研究所）、RPMI1640培養基（美國Hyclone公司）、DMEM/F12培養基（美國Hyclone公司）、特級胎牛血清（美國Gibco公司）、PE-anti-mouse CD8a（美國biolegend公司）、FITC-anti-m ouse CD28（美國biolegend公司）、200目細胞篩、10ml玻璃注射器。

1.3 方法

1.3.1 血清的制備：血清購自于北京中國軍事醫學科學院，無菌操作下，分別自月齡1.5～2月及月齡12～14月C57BL/6N雌性小鼠心臟內取血，自然沉淀4℃過夜，離心1000rpm/min，5min，提取上清液備用。

1.3.2 小鼠淋巴細胞懸浮液制備：以10%水合氯醛0.02ml腹腔注射，麻醉小鼠，75%酒精浸泡10min，無菌操作下剪開左下腹部皮膚進入腹腔，取出脾臟，PBS沖洗兩遍，放到200目細胞篩上用10ml玻璃注射器內芯進行研磨，研磨后用RPMI1640培養基沖洗兩遍，放入5ml小鼠淋巴細胞分離液中，2 500rpm、20min慢加速慢減速離心，吸取第二層白色渾濁層，均加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培養基10ml，細胞計數后備用。

1.3.3 分組和處理：① 年老鼠T淋巴細胞組：組I：年老鼠T淋巴細胞+10%年輕鼠血清溶液；②年老鼠T淋巴細胞組：組II：年老鼠T淋巴細胞+10%年老鼠血清溶液；③年輕鼠T淋巴細胞組：組III：年輕鼠T淋巴細胞+10%年輕鼠血清溶液；④ 年輕鼠T淋巴細胞組：組IV：年輕鼠T淋巴細胞+10%年老鼠血清溶液。

1.3.4 檢測：以上各組在37℃、5% CO2細胞培養孵箱里培養48h后，吸出淋巴細胞，離心后加入100μl細胞染色緩沖液，并加入PE-anti-mouse CD8a和FITC-anti-mouse CD28，4℃孵育60min，細胞染色緩沖液沖洗兩遍，用流式細胞儀檢測。

1.3.5統計學方法：采用SPSS 13.0統計軟件，所有數據用（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05有統計學意義。

2結果（表1、圖1）

I組和II組對比結果顯示：年輕血清在提高年老小鼠T細胞的CD8+CD28+共表達率方面比年老血清高。

I組和III 組對比結果顯示：年輕血清分別加入年老小鼠T細胞和年輕小鼠T細胞，前者的CD8+CD28+共表達率低于后者的CD8+CD28+共表達率。

III組和IV組對比結果顯示：年老血清能使年輕鼠的CD8+CD28+共表達率降低。

3討論

脾臟中的免疫細胞主要由T細胞和B細胞組成。衰老的T細胞的一個重要變化是CD8+CD28+分子表達降低；同時在衰老個體中出現了較多的CD28-T細胞的亞群[6]。這是因為CD28是T細胞表面一個主要的共刺激分子，對T細胞介導的免疫應答和刺激T細胞增殖及細胞因子的產生具有重要的作用，是反映T細胞衰老的重要指標。已有研究表明，老年人T細胞表面的CD8+CD28+共表達率與年青人相比有顯著降低[7]。筆者的研究也發現衰老小鼠的CD8+CD28+共表達比率低于年輕小鼠（另文發表）。所以，如果衰老鼠T細胞表面的CD8+CD28+共表達率升高，就可以認為T細胞變“年輕”了，T細胞的衰老發生了逆轉[8]。本實驗就是想通過研究血清微環境對T細胞表面標記CD8+CD28+的影響，為下一步免疫老化的研究打下基礎。研究結果初步揭示，年輕血清微環境能夠有效的提高衰老小鼠T細胞表面CD8+CD28+的共表達率。另一方面衰老血清微環境可以使年輕鼠的T細胞表面CD8+CD28+共表達率降低，使年輕的T細胞變“衰老”。綜合以上結果，說明了血清微環境對小鼠T細胞的衰老具有調節作用的影響。同時I和III組對比還發現，雖然年輕的血清微環境可以使年老鼠T細胞變“年輕”，但是仍然低于年輕鼠T細胞的CD8+CD28+共表達率。所以說，血清微環境可能只是起部分的作用，并不能使衰老的T細胞發生完全逆轉，具體機制還需進一步研究。

筆者認為，年輕的血清微環境之所以可以提高衰老鼠T細胞表面CD8+CD28+的表達率，可能與年輕的胸腺有關[9-10]，因為胸腺是T細胞發育、成熟的主要場所，并且它還是內分泌器官，能分泌如胸腺肽等多種活性物質進入血液[11]，從而改變血清成分，年輕的血清進一步可以改變T細胞的表面CD8+CD28+的表達；而衰老鼠由于胸腺發生脂肪化使衰老胸腺分泌的物質從量或質上發生改變[12-13]，從而出現衰老血清使年輕鼠的T細胞變“衰老”的現象[14]。

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[收稿日期]2011-04-17 [修回日期]2011-05-23

編輯/張惠娟

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