rhBMP2作用下人牙周膜成纖維細胞中cbfα1的表達研究

[摘要]目的：本實驗通過反轉錄聚合酶鏈反應，測定不同濃度的重組人骨形成蛋白2（rhBMP2）對人牙周膜成纖維細胞中cbfα1mRNA在不同作用時間點表達，了解rhBMP2對骨改建過程的調控。方法：原代培養人牙周膜成纖維細胞，取生長良好的第6代細胞，分別用25ng/ml、50ng/ml及100ng/ml的rhBMP2作用于細胞，于作用1、3、5、7天后收集細胞。反轉錄聚合酶鏈反應檢測各組細胞4個時間作用點cbfα1 mRNA含量，PCR產物1％瓊脂糖凝膠電泳后，采用Image Pro Plus5.0圖像分析軟件對電泳膠帶亮度進行分析。結果：不同濃度rhBMP2對cbfα1mRNA的表達均表現為初期降低，而后明顯增高，至峰值后回落。不同濃度對cbfα1 mRNA表達上調的峰值沒有明顯差異。100ng/ml和50ng/ml的rhBMP2濃度組能夠較快地上調cbfα1mRNA表達至峰值，然后100ng/ml組表現為緩慢下降，50ng/ml組迅速回落；25ng/ml組較慢上調cbfα1mRNA的表達至峰值后，迅速回落。結論：①根據實驗各組中cbfα1的表達變化，提示筆者BMP2可以上調HPDLfs中cbfα1的轉錄水平，并且對cbfα1的表達調控主要為啟動作用，cbfα1的表達增高幅度似乎與rhBMP2濃度并不相關。②高濃度組對cbfα1的上調作用迅速而持久，低濃度組的作用則相對遲緩而短暫。提示筆者BMP2可能通過上調cbfα1的表達而促進HPDLfs向成骨細胞轉化。

[關鍵詞]牙周膜成纖維細胞；rhBMP2；cbfα1

[中圖分類號]R783 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2001）06-0965-04

Study on the expression variety of cbfα1 in human periodontal ligament fibroblasts with rhBMP2 reaction

JI Ling-ling1，ZHOU Hong1，LI Ang2，RAO Guo-zhou2

(1.Department of Orthodontics，Stomatological Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，Shaanxi，China;2.Medicine Research Center ofStomatology，Xi'an Jiaotong University)

Abstract:ObjectiveBy RT-PCR to investigating the effects of rhBMPs in different concentration on the expression of cbfα1 in human periodontal ligament fibroblasts.To clarify the molecular mechanism of BMPs' regulation to the HPDLfs，which contribute to the bone rebuilding. Methods The 6th generation well-grown primary culture fibrocyte from HPDLfs were used in the experiment.The cells were subjected to different doses ofrhBMP2(25ng/ml，50ng/ml and 100ng/ml) for 1，3，5，7 days in this experiment.mRNA expression of cbfα1 were determined by semiquantitative RT-PCR approach.electrophoresis tape brightness was analyzed by graphical analysis software Image Pro Plus5.0.Results The expression of cbfα1mRNA acted by each rhBMP2 of different concentration fell down in primary stage，then increased obviously and decreased after reaching the peak value.The peak value of expression which reacted in different concentration presented no significant difference. When the expression of cbfα1mRNA regulated rapidly to peak value in both concentration 50ng/ml and 100ng/ml，the expression decreased smoothly in 100ng/ml，but decreased sharply in 50ng/ml.The expression increased smoothly and decreased sharply in 25ng/ml at the same time. Conclusion ① Based on the different expression variety of cbfα1 in experiments，the results showed that BMPs can enhance the mRNA of cbfα1 in HPDLfs and acted mainly as startup effect on the expression regulation of cbfα1. The enhanced amplitude of cbfα1 expression seemed to be no relation with the rhBMP2 concentration.②. The enhancive effect in high concentration on cbfα1 was quick and abiding，but it was slow and unabiding in low concentration.

Key words:human periodontal ligament fibroblasts;rhBMP2;cbfα1

牙齒受力后牙周膜成纖維細胞是最先接受該機械信號的細胞，通過一系列信號傳導誘發成骨細胞、破骨細胞等一系列細胞的分化，引起牙周組織改建，牙齒得以移動。而BMPs是這一型號通路中的重要細胞因子，可以促進HPDLfs向成骨細胞轉化并參與組織改建[1]。核心結合因子（cbfα1）是近年來發現的未分化間充質細胞向成骨細胞轉化的特異性轉錄因子，一些研究表明其可能參與了正畸牙齒移動過程中的牙周組織改建[2]。本實驗通過觀察不同濃度重組人骨形成蛋2（rhBMP2）不同作用時間下HPDLfs中cbfα1mRNA表達的變化，探討BMPs促進HPDLfs成骨分化的可能分子機制，以及與cbfα1的關系。

1材料和方法

1.1 主要試劑及儀器：Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶（Gibco公司），ABC免疫組化試劑盒（Vector，USA波形絲蛋白抗體，角蛋白抗體，rhBMP2（第四軍醫大學生化教研室），總RNA提取試劑盒TRIzol Reagent（Invitrogen公司），紫外分光光度計（Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro），反轉錄酶M-MLV Reverse Transcriptase (200Uμl)（Promega公司），反轉錄緩沖液M-MLV RT 5××Reaction Buffer （Promega公司），DNTP(10mM)天為時代，DNA MARKERⅢ（天為時代）。

1.2 HPDLfs的體外培養及實驗分組：①取材：取11～14歲因正畸矯治需要而拔除的健康年輕恒牙，采用組織塊消化培養法進行培養。②無菌處理：在超凈臺內用含雙抗的PBS從牙齒根方向冠方沖洗牙齒數次，用無菌手術刀片刮取牙根中部1/3處的牙周膜組織。③收集消化：將刮下的牙周膜組織置于PBS液中，移入離心管，離心（800r/6min），收集牙周膜組織，加入10倍體積的濃度為2%的Ⅰ膠原酶，置于CO2孵箱消化。④接種：約2h后，組織呈絮狀后，離心后收集組織，棄去膠原酶，加入含10%小牛血清（FCS），100μ/ml青霉素，100μ/ml鏈霉素的DMEM（低糖）培養液，充分吹打細胞懸液，接種于6孔培養板。接種量為每孔接種1顆牙齒的牙周組織量。⑤孵育：置于CO2孵箱，37℃培養。3天內保持培養板靜置，以利于組織貼壁。最早于第3天可見有細胞從組織塊中游出。當細胞生長達到孔板的30%時，進行細胞分散后，繼續培養，期間常規換液。⑥傳代：待細胞覆蓋孔板底達60%時，進行首次傳代。傳代時棄去舊培養液，加入0.25%胰蛋白酶2～3滴，以覆蓋孔底為宜，室溫下消化，2～3min，鏡下觀察，發現胞質回縮、細胞間隙增大后，立即終止消化，棄去上清，加入2ml培養液，充分吹打制成細胞懸液，以1:1將細胞懸液移入15ml培養瓶，加入足量培養液培養。以后以1:2進行傳代。免疫組化ABC法進行波形絲蛋白和細胞角蛋白抗體染色，作細胞來源鑒定。

為檢測不同濃度rhBMP2對體外HPDLfs中cbfα1mRNA表達的影響，用高壓滅菌生理鹽水將rhBMP2凍干粉配制成25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml 3個濃度組。各濃度組分別觀察作用1、3、5、7天后，HPDLfs中cbfα1mRNA表達的變化。

分組設計為：對照組：HPDLfs＋2%DMEM；B1組：25ng/ml rhBMP2＋HPDLfs＋2%DMEM；B2組：50ng/ml rhBMP2＋HPDLfs＋2%DMEM；B3組：100ng/ml rhBMP2 ＋HPDLfs＋2%DMEM。

取4塊6孔培養板，4個作用時間點各1塊。各培養板為3個濃度組及相應對照組。每孔接種細胞懸液2ml，在標準環境下以含10％FCS的DMEM培養液孵育24h后，棄去培養液及未貼壁的細胞。實驗組分別加入rhBMP2，終濃度為25、50、100ng/ml，含2％FCS的DMEM培養，對照組為僅含2％FCS的DMEM。作用1、3、5、7天后進行檢測。

1.3 反轉錄聚合酶鏈反應檢測cbfα1的表達

1.3.1細胞總RNA的提?。簵壢ッ靠椎呐囵B液，每孔用1×PBS 2ml洗1遍，棄去PBS加入1mlTRIzol。

1.3.1.1溶解分離：①用移液器將細胞從孔底吹下，吹打壁上的細胞，0～15℃靜止5min，移入ep管中。②加入200μl氯仿震蕩15s，15～30℃度靜止2～3min，離心（12 000r/15min）。

1.3.1.2沉淀RNA：①吸出上層水相，移入新的ep管中；②加入500μl的異丙醇，15～30℃孵育10min，2～8℃，離心（12 000r/10min），棄上清。

1.3.1.3洗滌：①加入1ml 70%乙醇（DEPC水配制）渦旋2～8min，離心（7 500r/5min）；②室溫干燥5～10min。

1.3.1.4溶解：加入20μl DEPC水溶解RNA，55～60℃孵育10min。

1.3.1.5保存：-70℃保存備用。

1.3.2 反轉錄：紫外分光光度計定量取2μg總mRNA，加入1μg oligodT，70℃水浴10min后，立即置于冰上；加入 M-MLV 5×Buffer 5μl，10mM dNTP 4μl，200U/μlM-MLVRT 1μl，42℃水浴鍋中60min。

1.3.3 PCR擴增

1.3.3.1引物設計

①cbfa1的分子引物序列：該引物將產生333bp的cDNA片斷。

上游引物5' GCTTCAACTGGGCCCTTTTTCAG 3'

下游引物5' CCATCAGCGTCAACACCATCATTC 3'

②β-actin分子引物序列：該引物序列由北京三博遠志生物技術有限公司合成。

上游引物5'TCCTGTGGCATCCATGAAACT3'

下游引物5'AACGCAGCTCAGTAACAGTC3'

1.3.3.2 PCR條件：在20μl的反應體系中，模板cDNA第1條鏈是1μl，cbfa1引物（10pm/μl）1μl，dNTP (10mM) 2μl，Mg++(25mM) 1μl，10×PCR Buffer2ul，tag plus DNA聚合酶0.5μl加滅菌水至20μl。反應條件為94℃變性 4min，94℃30s，54.5℃30s，72℃1.5min，35個循環。

1.3.3.3 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用Image Pro plus5.0測定電泳條帶熒光光密度值。

2結果

2.1 HPDLfs的形態觀察及鑒定結果：觀察到所培養細胞在形態上均呈長梭形或星形，胞突細長，胞體豐滿，胞漿均勻，中央有圓形或橢圓形的胞核，核仁清晰，一般有2～3個，呈成纖維細胞樣（如圖1）。免疫組化實驗顯示細胞波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來源（如圖2～3）。最初的5代細胞3～5天即可長滿培養瓶底，生長狀態活躍。6代以后的細胞，一般7～9天長滿瓶底，細胞增值穩定。

2.2 各濃度組cbfα1mRNA的表達變化：不同濃度的rhBMP2作用于人牙周膜成纖維細胞，cbfα1mRNA的表達隨作用時間的變化而發生變化。內對照基因β-actin為參照，各濃度組作用初期（1天）cbfα1的mRNA表達大幅度下降，當作用至3天時，各組mRNA的表達明顯上升，B2、B3組mRNA的表達均在此時達到峰值，且組間無明顯差異。

隨著作用時間的延長，各組mRNA的表達變化出現差異。B1組的表達繼續增高，于第5天達到峰值，且與其他兩組的峰值無明顯差異，繼續作用，第7天時，該組mRNA的表達恢復到作用前水平；B2組mRNA的表達則在第3天達到峰值后，迅速回落，并不隨作用時間的延長而繼續上升，于第5天回落到作用前水平；B3組mRNA的表達則在達到峰值后，隨時間的延長呈下降趨勢，但與B1、B2組相比，B3組mRNA的表達下降并不明顯，直至7天時，其mRNA的表達仍然高于對照組。RT-PCR凝膠成像結果如圖4～6。電泳條帶熒光光密度值見表1。

3討論

核心結合因子（cbfα1）是新近發現的成骨細胞分化和功能的關鍵因子[3]。已有研究表明[4]BMP2可以上調骨組織細胞中cbfα1mRNA，以調控其向骨系細胞分化。本實驗通過RT-PCR測定不同濃度rhBMP2不同作用時間下的HPDLfs中cbfα1mRNA的表達量，發現對照組中cbfα1mRNA有微弱表達，與楊瑛[5]等研究一致。說明HPDLfs是具有類似骨祖細胞特性，在一定的條件下，可以向骨系細胞進行轉化，進一步證明了HPDLfs在牙周改建中的作用。

3個濃度實驗組，cbfα1mRNA的表達均在rhBMP2作用1天后顯著降低，其后表達出現明顯的增高，說明rhBMP2可以調節HPDLfs中cbfα1mRNA的表達。提示我們rhBMP2可能通過上調HPDLfs中cbfα1的轉錄水平，使得其向骨系細胞分化，進而使細胞有成骨型表達。這與以往rhBMP2作用HPDLfs后引起細胞ALP活性增加、OC合成上升、礦化結節形成這些成骨型表現出現的研究[6]一致，并且更進一步從基因轉錄水平上對BMPs作用下HPDLfs向成骨細胞分化進行了解釋。

比較3個實驗組，可以看到不同濃度組其對HPDLfs中cbfα1的轉錄調控并不一致。一方面，就變化趨勢而言，B1（25ng/ml）和B2(50ng/ml)組均是在mRNA的表達增高達到峰值后迅速回落，而B3(100ng/ml)組則在峰值后呈現緩慢下降的趨勢，直到作用7天時，mRNA的表達仍然處于較高水平。另一方面，就cbfα1mRNA表達增高達到峰值的作用時間而言，B2組和B3組一致，均在作用的3天達到峰值，B1組在作用5天后達到峰值?？梢姼邼舛冉M對cbfα1上調迅速且作用持久，而低濃度組上調相對緩慢且作用時間短暫。提示我們，HPDLfs對低濃度rhBMP2的作用反應相對遲緩，且上調作用短暫；而對高濃度rhBMP2的作用反應迅速而持久。這支持了rhBMP2對HPDLfs的作用具有劑量依賴性，HPDLfs成骨型表達與BMPs作用濃度正相關的研究。推測高濃度的BMPs可能通過對cbfα1mRNA表達進行較長時間的作用，從而使HPDLfs成骨型比低濃度組表現更為顯著。

3個濃度組對細胞cbfα1表達上調的峰值無明顯差異，說明cbfα1表達上調的幅度與rhBMP2的作用濃度無關，這提示BMPs對cbfα1的表達調控更類似啟動部分，完全調控cbfα1的表達還需有其他因素。

本實驗中，各個濃度組在第1天的表達均低于對照組，對此，尚無一個明確完善的解釋。推測，rhBMP2直接作用于HPDLfs后，瞬時高濃度rhBMP2打破了細胞原本的平衡，可能啟動了HPDLfs胞內調節機制，存在特異的機制阻斷了中間信號分子，引起cbfα1的表達下降；隨著作用時間的延長，cbfα1的表達下降導致了中間信號分子轉錄水平的負反饋增加，而使cbfα1的表達在第3天表達升高。這與BMP2作用下人牙乳頭細胞的研究相類似。

目前，在對于體外人牙周膜成纖維細胞cbfα1的研究主要集中在細胞加力后cbfα1的表達變化。與本實驗不同的是，間歇性牽張力作用下HPDLfs中cbfα1的表達增高要迅速得多[7]，并且呈一過性反應[5]，并且猜想，cbfα1在外力作用下反應迅速而短暫，類似立即早期基因，可能在機械力誘導骨形成中起到“啟動子”或“扳機點”的作用。對比不同實驗模型，機械力直接作用和生物活性物質直接胞外作用，雖然都可以引起HPDLfs中cbfα1mRNA表達的增高，但顯然HPDLfs對機械信號和生物活性物質這兩種作用的反應性不盡相同。正畸力作用下，體內復雜環境中的HPDLfs中cbfα1究竟是通過怎樣的細胞信號傳導通路被激活，還需要進一步深入研究。

4結論

基于實驗各組中cbfα1的表達變化，提示我們BMPs可以上調HPDLfs中cbfα1的轉錄水平，并且對cbfα1的表達調控主要為啟動作用，cbfα1的表達增高幅度似乎與rhBMP2濃度并不相關。高濃度組對cbfα1的上調作用迅速而持久，低濃度組的作用則相對遲緩而短暫。

[參考文獻]

[1]Wescott DC，Pinkerton MN，Gaffey BJ，et al.Osteogenic gene expression by human periodontal ligament cells under cyclic tension[J].J Dent Res，2007，86(12):1212-1216.

[2]時 函，陳遠萍，史瑞新，等.核心結合因子α1與正畸牙移動中牙槽骨改建的相關性研究[J].上海口腔醫學，2007，16(5)：507-511.

[3]李華壯，周 躍，郭國寧.核心結合因子α1促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的實驗研究[J].中國修復重建外科雜志，2006，20(2)：121-124.

[4]余 擎，朱慶林，孫漢堂，等.核心結合因子α1在BMP-2調控細胞外基質蛋白表達中的作用[J].上?？谇会t學，2008，17(6)：611-615.

[5]楊 瑛，張 丁，王依祥，等.不同加力時間點人牙周膜細胞中核心結合因子(cbfα1)mRNA的表達變化[J].口腔正畸學2004，11(3)：119-125.

[6]司曉輝，劉 正.TGFβ和rhBMP2對人牙周膜成纖維細胞的作用[J].上?？谇会t學，2002，11(1):53-55.

[7]張云飛，段銀鐘，劉 鑫，等.人牙周膜細胞在彈性牽張力作用下核心結合因子的表達[J].第四軍醫大學學報，2003，24(9)：779-781.

[收稿日期]2011-03-10[修回日期]2011-05-03

編輯/何志斌

注：“本文中所涉及到的圖表、公式、注解等請以PDF格式閱讀”