小麥成熟胚離體培養研究

摘要：以美國小麥品種Overley成熟胚作為外植體進行離體培養，研究外源激素對小麥成熟胚誘導愈傷組織、分化出苗以及試管苗增殖的影響。試驗結果表明，在MS培養基中添加2，4-D 3 mg·L-1愈傷組織誘導頻率較高，成愈率為84.0%；在添加有KT 2~3 mg·L-1的MS分化培養基中愈傷組織分化率較高，可達85%以上；將試管苗轉接至添加0.2 mg·L-1的NAA和0.5~2.0 mg·L-1的6-BA的培養基中，試管苗有一定的分化增殖，但最高分化率僅為33.3%，增殖系數2.05。

關鍵詞：小麥；成熟胚；離體培養；植株再生

中圖分類號：S512.1文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.02.005

Study on Mature Wheat Embryos Culture in Vitro

SUN Ning1， ZHAO Xin-hai2， CHEN Xiao-qiang1， ZHANG Lei1

（1.Department of Agronomy， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384，China；2. Department of Computer Science and Information Engineering，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384， China）

Abstract：Mature wheat embryos of Overley were used as explants for culture in vitro. The result showed that the optimum medium for callus induction was MS+2，4-D（3.0 mg·L-1）， the rate of callus formation was 84.0%. The medium for callus differentiation was MS+KT（2~3 mg·L-1）， the differentiation of callus was more than 85%. The wheat plantlets had low differentiation rate and multiplication coefficient in MS+NAA（0.2 mg·L-1）+6-BA（0.5~2.0 mg·L-1）， which were 33.3% and 2.05.

Key words: wheat; mature embryo; in vitro culture; plant regeneration

目前，隨著生物技術的發展，利用生物技術方法改良小麥品種資源越來越受到重視。幼胚被許多研究者認為是用于小麥離體培養最有效的轉化受體，被廣泛用于體細胞無性系變異與基因遺傳轉化的研究，但幼胚的培養會受到季節、時間等限制，且難以重復試驗[1-2]；而小麥成熟胚具有良好的再生能力，具有種子保存期長、易獲得、取材方便、操作簡單、試驗周期短、成愈率高、愈傷組織成長快、一次成苗率高等優點，有助于解決以上的問題。

有關小麥成熟胚培養研究的報道中，愈傷組織的誘導及分化頻率的問題仍在探討，進一步改善成熟胚供體小麥種子的生理狀態，優化多種培養條件，提高胚性愈傷組織的形成能力，仍然是目前小麥成熟胚培養面臨的主要問題。因此，研究成熟胚組織培養的影響因素，并優化培養條件是提高小麥成熟胚離體培養效率的關鍵。

1 材料和方法

1.1材料

供試材為當年產美國堪薩斯州立大學引進的冬小麥品種Overley，選取籽粒飽滿、大小均勻一致的種子，取其胚作為培養材料。

1.2方法

1.2.1 愈傷組織誘導將小麥種子用清水沖洗凈，浸種24 h后備接種用。預處理后的小麥種子用75%的酒精浸泡30 s，然后用0.1%的升汞浸泡10 min，無菌水沖洗3～5遍。剝取小麥種子的成熟胚，接種于添加不同濃度2，4-D（1，3，5，7 mg·L-1）的MS固體培養基（蔗糖20 g·L-1）中進行愈傷組織的誘導。每處理接種50枚，重復3次。

1.2.2 分化培養取愈傷組織接種到分化培養基中，共設計7種激素處理，分別為：MS+6-BA 0.5 mg·L-1，MS+6-BA 1 mg·L-1，MS+6-BA 2 mg·L-1，MS+6-BA 3 mg·L-1，MS+KT1 mg·L-1，MS+KT 2 mg·L-1，MS+KT 3 mg·L-1，每種培養基中添加蔗糖15 g·L-1。

1.2.3試管苗的增殖培養誘導出苗培養30 d后，當試管苗生長到3～5 cm左右進行增殖培養，增殖培養基為MS＋NAA 0.2 mg·L-1＋6-BA（0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L-1）+蔗糖15 g·L-1+瓊脂6.4 g·L-1，pH 5.8。

1.2.4培養條件每日光照12 h，光照強度約為2 000 lx，室溫（25±2） ℃。

2結果與分析

2.1不同濃度2，4-D對小麥成熟胚愈傷組織誘導的影響

將小麥成熟種子的胚剝離，接種到添加有4種濃度2，4-D的MS培養基中，培養4～5 d后開始形成愈傷組織，部分成熟胚發生了發芽現象。培養20～30 d后，愈傷組織塊生長可達4～8 mm。由表1可以看出，不同濃度的2，4-D對小麥成熟胚產生愈傷組織的誘導效果不同，當培養基中添加2，4-D的濃度為3 mg·L-1時，成愈率可達84.0%；濃度為1 mg·L-1時的誘導效果較差，成愈率僅為74.0%；而當2，4-D濃度大于3 mg·L-1時成愈率隨濃度升高呈下降趨勢。說明，在較低濃度的2，4-D作用下愈傷組織的增殖速度較快，濃度過高增殖速度下降。

2.2不同激素種類與濃度對愈傷組織分化的影響

將小麥成熟胚愈傷組織轉接到添加有不同濃度KT和6-BA的MS分化培養基中，經過10 d左右愈傷組織上開始出現綠色的芽點，繼而從芽點處分化出芽并生長成苗，30 d后培養結果見表2。

可以看出，在MS培養基中添加一定濃度的細胞分裂素可以促進愈傷組織分化出試管苗，6-BA分化效果要略遜于KT的效果。當6-BA濃度在1~3 mg·L-1時，分化成苗率均達到50%以上，2 mg·L-1時分化率最高，為75.8%。在MS培養基中添加3 mg·L-1KT，分化出苗效果最佳，分化率可達89.3%。

2.3不同濃度激素配比對試管苗增殖的影響

小麥成熟胚的試管苗經過30 d的培養，當其生長到3～5 cm時移入含不同激素配比的培養基進行增殖培養，1個月后觀察每個處理的分化情況并記錄，結果如表3。可以看出，在MS培養基中共同添加定量的NAA和6-BA兩種植物生長調節劑可以誘導試管苗的分化增殖，在試驗所設NAA 0.2 mg·L-1、6-BA 1.5 mg·L-1處理時其分化率和增殖系數最高，但也僅為33.3%和2.05，總體的增殖效果并不理想。

3 討論與結論

在小麥成熟胚離體培養研究中，激素濃度和種類對愈傷組織的誘導和分化有較大的影響。2，4-D能較好地誘導愈傷組織，并可抑制小麥成熟胚培養中的胚萌發現象，但其濃度要控制適當，并不是越高越好，當其濃度與內源激素達到一定的平衡時才會獲得最佳的誘導效果。本試驗中，在1～7 mg·L-1這個較為寬泛的濃度范圍內2，4-D對小麥成熟胚的愈傷組織培養的總體誘導效果均比較理想，其中以3 mg·L-1為最宜，低于或高于此濃度成愈率均有所下降。部分研究報道，在2，4-D 8 mg·L-1時誘導效果較好，成愈率達90%~100%[3-5]，與本試驗激素濃度和成愈率有較大差異的原因可能為所用材料的基因型和生理生化狀態不同引起的。一些研究者[6]提出，雖然2，4-D對愈傷組織的形成有較好的促進作用，但高濃度2，4-D對愈傷組織的分化不利，其原因可能是2，4-D濃度高，消耗慢，長時間作用于愈傷組織，導致分化率降低。因此，許多愈傷組織分化研究在激素應用上盡量降低2，4-D濃度或不添加。

本試驗研究了KT和6-BA對小麥成熟胚愈傷組織分化的影響。添加KT的分化培養基的分化率均在80%以上，而添加6-BA的分化培養基的分化率最高為75%。可見，KT、6-BA對小麥成熟胚的愈傷組織的分化都具有一定的促進作用，且KT的效果要優于6-BA。此外，有研究者[7-9]認為，單獨使用KT或其它細胞分裂素并不能提高愈傷組織分化率，只有當高濃度的細胞分裂素與少量生長素配合使用時，才能有效地提高愈傷組織分化率。而在本試驗中，分化培養基中只添加了細胞分裂素KT，也取得了很好的效果。這些結果的差異可能是由于材料本身內源激素水平不同而致。

對小麥離體培養條件下的增殖研究，多數報道主要是針對其愈傷組織的增殖，一般采用與愈傷組織誘導培養基相類似的配方，如在MS或N6等培養基中添加1~3 mg·L-1 2，4-D、NAA等生長素[10-12]，直接應用小麥試管苗進行增殖的研究報道較少。李浚明等[13]以去除根、莖的小麥試管苗莖段為試材，接種于添加IAA10 mg·L-1的改良N6培養基中，培養2~3周后可獲得長有新根的叢生分蘗苗。本試驗將小麥試管苗接種到含有NAA 0.2 mg·L-1和6-BA 0.5~2.0 mg·L-1的MS中培養30 d后，試管苗分化增殖效果并不理想，最高分化率和增殖系數僅為33.3%和2.05。

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