天津地區奶牛乳腺炎金葡菌黏附素Fnbp A基因檢測

摘 要：金黃色葡萄球菌黏附素Fnbp A是引起奶牛乳腺炎的關鍵因素之一，對金黃色葡萄球菌的黏附環節進行阻斷，進而減少或阻止金葡菌相關毒素和莢膜的表達，以黏附素蛋白為靶抗原的亞單位疫苗是預防奶牛金葡菌乳房炎的發展方向之一。對天津及周邊地區奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌臨床分離株的黏附素Fnbp A基因檢測研究，結果表明96%的臨床分離株攜帶此基因，為進一步研究天津地區奶牛乳房炎金葡菌亞單位疫苗提供理論依據。

關鍵詞：奶牛乳腺炎；金黃色葡萄球菌；Fnbp A；檢測

中圖分類號：S823.9+1 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.05.013

Detection of Staphylococcus aureus Adhesin Fnbp A of Cow Mastitis in Tianjin

SUN Ying-feng1， YANG Hong-jun2， CHI Jing-jing1， WANG Dong1， XU Xuan1

(1. Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veternary Medicine，Tianjin 300112，China; 2. Dairy Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan， Shandong 250100，China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ: Staphylococcus aureus adhesin Fnbp A was one of the key factors that caused cow mastitis. If we intervene S.aureus adhesion ，and then it could reduce or prevent expression of toxin and capsule， and the adhesin as a target for vaccine development may be effective way to prevent the cow S.aureus mastitis. This study is doing research of Tianjin and surrounding areas cow mastitis clinical isolates of S.aureus adhesin Fnbp A of genetic， the results show 96% isolates stains carrying this gene. This test provids a theoretical basis for further study in Tianjin S. aureus subunit vaccine.

Key words: cow mastitis; S.aureus; Fnbp A; detection

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的重要病原之一，該菌定植于奶牛乳房、乳頭及軀體其他部位。乳頭皮膚皸裂，可促進該菌的滋生，而且該病原菌可以通過擠奶器的奶襯、乳房毛巾及擠奶人員手部接觸后，從感染部位向未感染的乳區傳染。臨床感染的乳區主要表現為腫脹、乳凝塊等，嚴重可引起壞疽性乳房炎，嚴重降低了產奶量，影響奶牛的利用年限，造成奶牛養殖巨大的經濟損失[1]。

金黃色葡萄球菌感染機體開始于細菌對宿主細胞的粘附。通過粘附作用病原菌才得以侵襲機體細胞。纖連結合蛋白A（Fnbp A）是金黃色葡萄球菌重要黏附素之一。目前，國外已有關于黏附素生物學活性及亞單位疫苗研究的報道 [2-3]。基于奶牛乳腺炎金葡菌的感染特性，本研究針對天津地區金黃色葡萄球菌的臨床分離株進行黏附素Fnbp A基因檢測，為進一步研究天津地區奶牛乳腺炎金葡菌亞單位疫苗提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

天津及周邊地區奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌臨床分離株，金黃色葡萄球菌標準株（Sta.aureus ATCC 25923）及大腸桿菌(E.coli ATCC 35218)由山東農業大學動物醫學院傳染病教研室贈與；無乳鏈球菌(Str.agalactiae CVCC 1886)購于中國獸醫微生物菌種保藏中心。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計 參考楊宏軍等[4]報道的金黃色葡萄球菌Fnbp A檢測，設計引物，由上海生工生物公司合成引物。

P1：5- AAGTTTTAGAAGGTGGAAAGATTAG-3

P2： 5-GCTCTTGTAAGACCATTTTTCTTCAC-3

1.2.2 金黃色葡萄球菌模板DNA提取 將金黃色葡萄球菌標準及天津地區臨床分離株接種在THB液體培養基中，37 ℃搖菌18 h，分別取1 mL金葡菌菌液加入離心管中，10 000 r·min-1 離心3 min，棄上清液，TNE洗滌1次，200 μLTEbuffer重懸菌液，加入50 mg·mL-1溶菌酶4 μL，37 ℃ 水浴

1 h，加入25 mg·mL-1蛋白酶K 4 μL，55 ℃水浴 1 h后，煮沸10 min，冰浴，10 000 r·min-1離心10 min， 取上清液作為試驗模板DNA。

1.2.3 PCR反應循環條件 參考楊宏軍等[4]報道，將PCR反應循環條件優化。反應參數如下：95 ℃ 預變性 5 min，94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃，1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4 PCR產物純化及克隆測序 將PCR產物瓊脂糖電泳切膠，按照凝膠回收試劑盒操作步驟，回收目的Fnbp A基因片段。將目的基因片段連入pMD18-T測序載體，轉化感受態細胞；取適量轉化后的菌液涂布氨芐陽性LB平板，37 ℃溫箱培養24 h，進行藍白斑篩選。將挑取菌落提取模板，進行PCR鑒定，陽性菌落送上海生工生物公司測序。

1.2.5 特異性試驗 將金黃色葡萄球菌標準菌株及天津地區臨床分離株，無乳鏈球菌、大腸桿菌標準株提取模板，進行特異性試驗。

1.2.6 臨床分離株Fnbp A基因檢測 對近幾年來本實驗室分離并保存的天津及周邊地區奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌臨床分離株進行Fnbp A基因檢測。

2 結果與分析

2.1 特異性試驗結果

特異性試驗結果表明：金黃色葡萄球菌及臨床分離株在642 bp擴增出目的特異條帶（圖1），無乳鏈球菌及大腸桿菌均為擴增出任何條帶。

2.2 Fnbp A基因測序結果

將測序結果輸入NCBI，利用BLAST軟件進行同源性分析。結果表明，所擴增Fnbp A目的片段與GeneBank中公開發表核酸序列同源性98%。

2.3 臨床分離株Fnbp A基因檢測結果

通過對天津及周邊地區奶牛乳腺炎金葡菌臨床分離株50株Fnbp A基因檢測：天津地區奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌Fnbp A基因攜帶率為96％。

3 結 論

近幾年，隨著市場經濟的發展，中國乳業發展較快。但是人們在注重加快乳業發展步伐、追求高產的同時，乳房炎的發病率居高不下。2005年以來，本實驗室對天津地區奶牛場臨床型乳房炎進行了較為細致的流行病學研究，結果表明金黃色葡萄球菌檢出率為52%，證實金黃色葡萄球菌是本地引起奶牛乳房炎的主要病原菌。因此，針對金黃色葡萄球菌防治研究，對減少天津及周邊地區奶牛乳房炎的發生率，提高奶產量具有重要意義。

目前研究顯示，金黃色葡萄球菌表面的黏附素在疾病感染方面是重要的先決條件。FnbpA是金黃色葡萄球菌表面重要的黏附蛋白之一，是一個較好的抗原靶點，可作為新型的亞單位疫苗研究靶點[5-6]。通過本次試驗，對天津及周邊地區奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌臨床分離株Fnbp A基因檢測，研究表明96％以上金葡菌臨床分離株存在黏附素Fnbp A基因，證實在天津及周邊地區奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌流行株攜帶黏附素Fnbp A基因，這就為我們進一步研究天津及周邊地區奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌亞單位疫苗提供了理論依據。

參考文獻：

[1] 孫英峰，王東，池晶晶，等. 奶牛乳房炎的預防與治療技術[J]. 天津農業科學，2010，16(3):67-68.

[2] Gabriel L， Nathan Y， Evgenia L， et al. Development of a Staphylococcus aureus vaccine against mastitis in dairy cows. II. Field trial [J]. Veterinary Immunology and Immunopathology ， 2003(93): 153-158.

[3] Kenneth C， Ingham， Shelesa B， et al. Interaction of Staphylococcus aureus fibronectin-binding protein with fibronectin[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2004， 279(41): 42945-42953.

[4] 楊宏軍，高運東，王長法，等. 雙重PCR檢測奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌粘附素clfa A和Fnbp A基因[J].中國獸醫學報，2008，28(8):906-908.

[5] Adriana R， Patrice F， Li D M， et al. Modulation of fibronectin adhesins and other virulence factors in a teicoplanin-resistant derivative of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. Antimicrobial agents and Chemotherapy，2004，48(8): 2958-2965.

[6] Hall A E， Domanski P J， Patel P R， et al Characterization of a protective monoclonal antibody recognizing Staphylococcus aureus MSCRAMM protein clumping factor A[J]. Infection and Immunity， 2003， 71（12）：6864-6870.

收稿日期：2011-07-27；修訂日期：2011-08-25

基金項目：天津市農科院院長基金項目（08012）；天津市科技支撐計劃重點項目(09ZCGYNC00100)

作者簡介：孫英峰（1979-），男，山東新泰人，助理研究員，碩士，主要從事奶牛疾病研究。