諸葛菜變異植株無性系建立與快速繁殖的研究

摘 要：為保存諸葛菜的有利變異，滿足栽培變異植株對種苗的需要，以變異植株嫩莖為材料，采用組織培養的方法，進行了嫩莖的生根培養、試管苗生根繼代培養、試管苗的移栽和定植的研究，以建立起變異植株的無性系和快速繁殖體系。研究結果表明：1/2MS+NAA0.2 mg·L-1是變異諸葛菜嫩莖生根培養、試管苗生根繼代培養和快速繁殖的理想培養基；定植的試管苗不僅保持了諸葛菜的所有生物學性狀，而且有利變異性狀也保持不變。由嫩莖建立起的諸葛菜變異植株無性系的快速繁殖體系，能使有利變異的種質得到保存，可滿足栽培對種苗的需求。

關鍵詞：諸葛菜；變異植株；無性系；快速繁殖

中圖分類號：S681.9 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.05.015

Study on Establishement of the Clone and Rapid Propagation of Orychophragmus violaceus

SONG Yun，WANG Shi-yue，ZHAO Xue，YANG Wen-xin，JIANG Chang-yang

(College of Life Science， Liaoning Normal University， Dalian，Liaoning 116029， China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ: In order to preserve the favorable variations and meet the needs of germchits for planting variation plants， with method of tissue culture， tender stems of Orychophragmus violaceus variation plants were used as material to do the research on rooting， subculture of tube seedlings’ rooting， transplanting of tube seedlings and to establish the clone and rapid propagation of variation plants. The results showed that 1/2MS+NAA0.2 mg·L-1 was the best medium for rooting， subculture of tube seedlings’ rooting and rapid propagation of Orychophragmus violaceus; planting seedlings not only kept all biological characteristics of Orychophragmus violaceus， but also maintained the advantageous variation characters. It also indicated that the rapid propagation of clone from tender stems of Orychophragmus violaceus variation plants could preserve the germ plasm of advantageous variation and meet the needs of germchits for planting.

Key words: Orychophragmus violaceus; variation plants; clone; rapid propagation

諸葛菜（Orychophragmus violaceus）又稱二月蘭，屬于十字花科，諸葛菜屬一年生或二年生草本植物[1]。生長于平地、山坡、林緣或林下，分布于中國的東北、西北、華北和華東等地 [2-3]。諸葛菜的嫩莖葉不僅可鮮食，也可鹽漬食用。又因諸葛菜開花早，花朵、花色美麗鮮艷，所以近年來在遼寧南部地區，又多用于觀賞栽培。在較大面積的觀賞栽培中，我們先后發現3株生長非常旺盛，花期延長15～20 d的諸葛菜變異植株，用這種植株的種子繁殖的后代，由于基因的分離作用，使花期延長的有利變異無法得到保持。為保存有利變異的種質、滿足人們觀賞栽培的需要，當我們再次發現這種變異植株時，采用組織培養的方法，對其進行了無性系建立和快速繁殖的研究。雖然目前已多有十字花科植物組織培養研究的報道[4-5]，并有諸葛菜組織培養研究的報道[6-8]，但迄今未見諸葛菜有利變異植株組織培養及無性系研究的報道。

1 材料和方法

1.1 材料處理

當在成片栽培的諸葛菜中，發現了提前15 d左右發芽生長的諸葛菜變異植株后，待其生長到高20 cm左右時，在根部澆透1/4MS+6-BA0.1 mg·L-1+ NAA0.1 mg·L-1的同時，將頂端剪掉，促進分蘗。待生長1個月左右，已經生長形成多個側枝時，將地上部剪下，作為試驗材料。

1.2 材料滅菌

材料滅菌參見參考文獻[9]。

1.3 培養條件

培養條件參見參考文獻[10]。

1.4 試驗方法

1.4.1 莖段生根培養 把無菌莖段剪成長2 cm左右，具有2個葉片（實際上是具有2個生長點）的莖段，將所獲得的38個莖段分別接種到以下3種培養基上，對無菌莖段進行直接生根培養。這3種培養基分別是：（1）1/2MS+IAA0.2 mg·L-1；（2）1/2MS+NAA0.2 mg·L-1；（3）1/2MS+NAA0.1 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1。

1.4.2 試管苗生根繼代培養 把以上培養的生根試管苗剪成長1～1.5 cm、具有兩個葉片的莖段后，再把莖段下部的莖，在葉柄基部呈約45度角切掉，接著把莖段垂直插入（接種）以MS、1/2MS、1/4MS為基本培養基，附加濃度為0.2 mg·L-1NAA的3種培養基中，進行不同培養基對試管苗的生根繼代培養的影響試驗。生根繼代培養試驗重復3次，每次在篩選出的理想培養基上進行8代繼代培養。

1.4.3 試管苗的移栽與定植 把生長著繼代培養試管苗的培養瓶移到溫室中，打開瓶塞，在較強的光照下煉苗2 d，將試管苗取出，洗凈根部的培養基，然后移栽到上半層為干凈河沙，下層為肥沃園土的營養缽中。移栽試驗重復2次，每次移栽800株。

把在溫室中移栽成活的試管苗，于3月中旬定植到花園的樹叢旁。移栽試驗重復2次，共移栽1 500株。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對莖段生根的影響

將變異諸葛菜無菌莖段接種到生根培養基上培養28 d，對生根情況進行統計，結果見表1。由表1可見，在接種培養的3種培養基上，所接種的材料均可生根，其中（1）和（2）培養基生根率高；若從每株試管苗的生根數和長勢看，在（2）培養基上，不僅根數最多，而且生長旺盛。觀察表明，在（2）培養基上接種培養到5 d時可見培養莖段基部長出新根，隨后，伴隨著根系的生長、根數的增加，試管苗也旺盛的生長。培養到28 d時，與在（1）號培養基上培養的試管苗相比，出現了以下特點：莖粗壯，葉片伸展，葉片嫩綠，在先發出的每條根旁又長出6～15條白色側根，生根試管苗平均株高4.3 cm。以上結果說明：1/2MS+NAA0.2 mg·L-1培養基是變異諸葛菜莖段生根培養的理想培養基。

2.2 試管苗生根繼代培養與快速繁殖

試管苗生根繼代培養到24 d時觀察統計，結果見表2。由表2可見，在3種培養基上繼代培養的試管苗均可生根，其中以1/2MS+NAA0.2 mg·L-1培養基效果最好。在這一培養基上，不僅所培養的試管苗生根率最高、每株試管苗的生根數最多，而且試管苗長勢旺盛，幾乎沒有無效苗。并且在這種培養基上連續繼代培養8代，試管苗的生根率高、平均生根數多、長勢旺盛。觀察還表明，在這種培養基上采用生根繼代的方法繁殖的試管苗，不僅生長旺盛，而且幾乎沒有無效苗。統計表明，3次重復試驗，每次繼代培養8代，平均每代的繁殖系數為2.6。按照這種繁殖速度，預計每年能繁殖出2.615.2（近200萬）株試管苗，這種繁殖速度完全能滿足人們對有利變異植株進行種質保存和栽培時對種苗的需要。以上結果說明：1/2MS+NAA0.2 mg·L-1培養基也是變異諸葛菜試管苗生根繼代培養和快速繁殖的理想培養基。

2. 3 試管苗的移栽與定植

2次移栽試驗，移栽后30 d統計，成活1 521株，平均成活率為95.1%。2次定植試驗，定植后30 d統計，成活1 492株，平均成活率為99.5%。

定植后的試管苗初期生長緩慢，植株較小，40 d后開始迅速生長。后期觀察表明，這種由變異植株繁殖的試管苗不僅保持了諸葛菜的所有生物學性狀，而且生長旺盛、花期延長15～20 d的有利變異也保持不變。這說明，采用無性系建立繁殖的諸葛菜有利變異植株的試管苗，能使有利變異性狀保持不變。

3 討 論

本研究所定植的諸葛菜變異植株試管苗有利變異性狀得到保持這一結果說明：通過組織培養建立的無性系，能使有利變異的種質得到保存，這為諸葛菜有利變異在生產上的應用奠定了技術基礎。

在本研究中，以來自田間的無菌莖段為材料進行生根培養，培養周期為28 d，而以試管苗的莖段為材料進行生根培養，培養周期為24 d，后者的培養周期縮短了4 d。產生這種現象是由于以下原因引起的：一是前者是經過完全的滅菌處理而獲得的材料，在滅菌過程中，滅菌劑在殺死了材料上所帶的各種雜菌的同時，也使材料受到了嚴重傷害，使其生命力減弱，生根時間延長；二是前者原來在田間生長，適應于土壤等外界環境，而進入培養瓶后，需要對培養基等新環境形成新的適應性，才能正常生長生根，而后者材料是來自培養瓶中的，并且其培養基相同，它們對這樣的培養環境具有了較強的適應性，因此就出現了培養周期縮短的現象。

參考文獻：

[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒[M].北京:科學出版社，1980:35.

[2] 李書心.遼寧植物志[M].沈陽:遼寧科學技術出版社，1988:620-622.

[3] 韓全忠，王正興.大連地區植物志(上冊)[M].大連:大連理工大學出版社，1993:258.

[4] 楊乃博.用組織培養方法繁殖十種植物的試驗[J].植物生理學報，1998，5(4):369-377.

[5] 孟志卿，徐東生，王繼珍.羽衣甘藍組織培養研究[J].武漢大學學報：理學版，2005，51(2):273-277.

[6] 陳艷紅，羅鵬.飼用植物諸葛菜下胚軸高頻率植株再生研究[J].四川草原，2001，(3):50-52.

[7] 葉秋，藍澤菠.諸葛菜花器官組織培養與植株再生[J].中國油料作物學報，1998(2):7-9.

[8] 吳俊，羅勤，游大慧，等.湖北諸葛菜組織培養與植株再生[J].四川大學學報，2004:41(5):1088-1090.

[9] 張楠，朱姝婉，袁靜，等. 野生豆瓣菜嫩莖無性系建立的研究[J].天津農業科學，2008:14(1):17-19.

[10] 安曉云，慈嘉，申瓊.鹿藥組織培養研究[J].中國園藝文摘，2010(10):13-15.

收稿日期：2011-07-12；修訂日期：2011-08-18

基金項目:遼寧省高等教育教學改革資助項目（20090304）；遼寧師范大學教學改革資助項目（LSJG：20090108）

作者簡介：宋云（1989-），女，遼寧大連人，在讀本科生，主要從事植物組織培養研究。

通訊作者簡介：姜長陽（1953-），男，遼寧大連人，教授，主要從事植物生物技術研究。