類胡蘿卜素代謝途徑上游基因?qū)Τ嗝顾厣锖铣傻挠绊懸约俺嗝顾氐姆肿由飳W(xué)效應(yīng)

摘 要：對赤霉素和脫落酸前體物質(zhì)類胡蘿卜素的關(guān)系進(jìn)行了分析和探討，發(fā)現(xiàn)二者之間存在著密切的聯(lián)系，尤其是類胡蘿卜素代謝途徑的上游基因?qū)Τ嗝顾睾铣捎泻艽笥绊?。此外，全面深入的了解赤霉素的性質(zhì)、生物學(xué)效應(yīng)等，有利于我們更好地理解它如何在植物生長發(fā)育中發(fā)揮作用，從而改善其應(yīng)用效果。

關(guān)鍵詞：赤霉素；生物合成；類胡蘿卜素；生物學(xué)效應(yīng)

中圖分類號：Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.05.008

Influence of Carotenoids Metabolic Pathway Upstream Genes to Gibberellic Acid Biosynthesis and Its Molecular Biology Effect

YANG Hai-lan，JI Jing，WANG Gang，GUAN Chun-feng

（College of Agricultural，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ: The relations between gibberellic acid and carotenoids (precursor substances of abscisic acid) were studied and discussed in this paper， and we found that they had strong relationships， especially the upstream genes in carotenoids metabolic pathways， which had a very great effect on gibberellic acid synthesis. In addition， as comprehensive deep learing on the nature of gibberellic acid and it’s biological effect， we can better understand the role that it plays in the plant development， and to improve its application value as well.

Key words: gibberellic acid；biosynthesis；carotenoids；biological effect

植物激素是植物自身合成的痕量生長調(diào)節(jié)分子的總稱。植物體內(nèi)有七大類激素，包括赤霉素、脫落酸、乙烯、生長素、細(xì)胞分裂素、油菜樹甾醇和最新發(fā)現(xiàn)的獨角金內(nèi)酯， 類胡蘿卜素是脫落酸的前體物質(zhì)，它和赤霉素對調(diào)節(jié)植物體生長發(fā)育發(fā)揮著極其重要的作用。對其二者間相互關(guān)系的研究有利于更加清楚地了解植物各種生理活動的機(jī)理，掌握其規(guī)律，讓其更好地為我們所用。

赤霉素是一種高效能的廣譜植物生長調(diào)節(jié)劑。在20世紀(jì)70年代初中國就已經(jīng)實現(xiàn)了赤霉素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用。利用農(nóng)作物本身的赤霉素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷所產(chǎn)生的矮化植株來培育抗倒伏農(nóng)作物新品種，從而大幅度提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量，這就是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上第一次“綠色革命”[1]。所以，對赤霉素的利用有很大的發(fā)掘潛力。類胡蘿卜素通常是指C40的碳?xì)浠衔铮ê}卜素）和它們的氧化衍生物（葉黃素）兩類色素的總稱。在植物中，類胡蘿卜素?fù)?dān)當(dāng)葉綠體光合作用的輔助色素并保護(hù)葉綠素免受強光破壞[2]。在人和其它動物體內(nèi)，一些類胡蘿素（α-類胡蘿卜素，β-類胡蘿卜素，β-隱黃質(zhì)）是維生素A的前體物質(zhì)，稱為維生素A原，是防止維生素缺乏的重要營養(yǎng)物質(zhì)。每年維生素A缺乏癥導(dǎo)致25萬～50萬的兒童失明，其中一半人數(shù)死于維生素A缺乏的相關(guān)疾病。此外，類胡蘿卜素還有清除自由基、延緩衰老、增強機(jī)體免疫力、預(yù)防癌癥等重要作用[3]。

類胡蘿卜素的代謝途徑上游基因?qū)Τ嗝顾氐暮铣捎幸欢ǖ挠绊?，通過這一特點我們來認(rèn)識、研究二者的關(guān)系。此外，通過對赤霉素的合成、信號調(diào)控、理化性質(zhì)、植物中檢測等方面，了解其分子生物學(xué)效應(yīng)。

1 類胡蘿卜素與赤霉素的關(guān)系

首先，在合成上，類胡蘿卜素和赤霉素有共同的上游途徑（圖1）。類胡蘿卜素是由5碳化合物異戊基二磷酸( IPP)構(gòu)成。通過葡萄糖1-13C標(biāo)記實驗，在較高等植物中發(fā)現(xiàn)IPP存在兩條合成途徑。赤霉素及葉綠素相關(guān)的類異戊二烯（β-胡蘿卜素，葉黃素，葉綠素和9-質(zhì)體醌的戊烯鏈等），主要是通過一種MEP途徑（甘油磷酸鹽/丙酮酸途徑）合成的，這最早發(fā)現(xiàn)于真菌和綠藻中。在細(xì)胞質(zhì)中主要是MVA（乙酸/甲羥戊酸）途徑合成IPP，它在合成菜油甾醇上有重要作用。而研究表明，在MVA受到限制的條件下，MEP途徑也可以促進(jìn)GA和類胡蘿卜素的合成[4-5]。

Blanc 和Pichersky[6]首先克隆了IPP異構(gòu)酶（IPPI）的cDNA。IPPI 催化IPP 形成DMAPP，推測IPPI 也可能是植物類胡蘿卜素合成的限制因素。在高等植物中， GGDPS是一種多功能異戊烯轉(zhuǎn)移酶，可催化GGP，F(xiàn)PP及GGPP的合成反應(yīng)。它可通過親和層析從紅椒果實的葉綠體中分離出來。該酶的基因( GGDP) 也已被克隆得到。GGPS 是萜類物質(zhì)合成的一個重要分支點酶。

類胡蘿卜素在植物的許多生理過程中具有重要作用，八氫番茄紅素脫氫酶基因（PDS3）在類胡蘿卜素合成過程中編碼其中一個重要的酶。有人通過對矮化植物的研究，發(fā)現(xiàn)PDS3基因的表達(dá)影響到20個代謝途徑，其中包括赤霉素的生物合成途徑[7]。蝦青素是一種紅色的類胡蘿卜素，在體內(nèi)可與蛋白質(zhì)結(jié)合而呈青、藍(lán)色，有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病作用。Yandu Lu等人對雨生紅球藻進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中赤霉素誘導(dǎo)蝦青素的合成，與β-胡蘿卜素酮化酶（ketolase）基因（bkts）轉(zhuǎn)錄的上游調(diào)控密切相關(guān)。經(jīng)過實驗分析，赤霉素中一類GA3的處理促進(jìn)了β-胡蘿卜素ketolase基因的轉(zhuǎn)錄。在bkt 5＇-側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)存在赤霉素應(yīng)答順式作用元件，這表明赤霉素構(gòu)成蝦青素合成網(wǎng)絡(luò)的信號[8]。從這些研究中我們可以看出，赤霉素和類胡蘿卜素在合成途徑上相互影響，相互調(diào)節(jié)，共同在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用，對于它們?nèi)绾卧诃h(huán)境變化中進(jìn)行調(diào)節(jié)還需進(jìn)一步的研究。

2 GA的理化性質(zhì)及其作用

至今，人們已發(fā)現(xiàn)一百多種赤霉素，按其發(fā)現(xiàn)的順序命名為：GA1，GA2，GA3……它們的基本結(jié)構(gòu)是20C的赤霉烷，它是由4個異戊二烯單位組成，含有4個碳環(huán)的雙萜類物質(zhì)。GA3是最早被分離出來的赤霉素，其性質(zhì)具有一定的代表性。赤霉素GA3能很好地溶解于醇類(如甲醇、乙醇)、丙酮、醋酸乙酯、冰乙酸等有機(jī)溶劑和磷酸鹽緩沖溶液中。微溶于水、醚中，不溶于石油醚、苯、氯仿等溶液中。在溫度較低的酸性條件下，比較穩(wěn)定。赤霉素GA3不能以水溶液的形式在室溫下長期保存。GA3與硫酸作用，生成熒光物質(zhì)，在紫外線激發(fā)下呈現(xiàn)藍(lán)綠色熒光，在一定的濃度范圍內(nèi)，GA3的濃度與產(chǎn)生熒光強度成正比，因此，我們可以根據(jù)這一特性，運用熒光法來測定其含量[9]。

高等植物中的赤霉素主要存在于幼根、幼葉、幼嫩種子和果實等部位，在植物體內(nèi)運輸時無極性，通常由木質(zhì)部向上運輸，由韌皮部向下或雙向運輸。赤霉素最顯著的效應(yīng)是促進(jìn)植物莖的伸長。赤霉素的生物學(xué)效應(yīng)主要是：增加植物細(xì)胞分裂，促進(jìn)木聚糖的合成，促使植物細(xì)胞伸長。

近年來，許多學(xué)者對其作用進(jìn)行了研究，筆者以玉米為例進(jìn)行了總結(jié)：（1）在種子吸脹、萌動階段， GA3 能明顯促進(jìn)種子吸水和加快種子萌動， Ca2+ 則表現(xiàn)出延緩種子吸水和萌動; GA3 和Ca2+ 能顯著提高玉米種子的發(fā)芽勢和簡化活力指數(shù)， 且表現(xiàn)出一定的加成作用，但對種子發(fā)芽率沒有影響; GA3 能顯著促進(jìn)玉米種子根的生長， Ca2+ 對玉米芽的生長有顯著的促進(jìn)作用[10]。（2）赤霉素能促進(jìn)種子發(fā)芽和幼苗的生長[11]；（3）赤霉素能促進(jìn)雄穗的發(fā)育提前抽雄，濃度大時會致使雄穗發(fā)育不完全或敗育。雜交時用于促進(jìn)花期相遇[12]。（4）與玉米的雜種優(yōu)勢有關(guān)。外源GA3促進(jìn)全部基因型的苗高，其中自交系最敏感，還使勢能比降低， 因而降低了雜種優(yōu)勢[13]。（5）氯乙烯醇(PVA)與赤霉素(GA)混合處理玉米種子對其萌發(fā)、代謝、生長及產(chǎn)量有影響。 這一處理方法能明顯提高種子活力，促進(jìn)萌發(fā)，加快萌發(fā)代謝，增強抗旱性[14]。

3 赤霉素的合成途徑

GA生物合成中需要多種酶的參與，如古巴焦磷酸合成酶(CPS)、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(KS)、內(nèi)根-貝殼杉烯19-氧化酶(EKO)、內(nèi)根壩殼杉烯酸7β羥化酶、GA12-醛合成酶、GA-7-氧化酶(GA7ox)、GA13-羥化酶(GA13ox)、GA20-氧化酶(GA20ox)、GA3β羥化(GA3βox)和GA2-氧化酶(GA2ox)等（15）。合成共分為3個階段[16]。首先，GGPS經(jīng)CPS催化形成CPP，接著由KS將其環(huán)化。其中，CPS對GA的合成起著重要的作用。Ent-kaurene的C-19甲基被KO多次氧化分別形成Ent-kaurenol、Ent-kaurenal、Ent-kaurenoic acid，這是赤霉素合成的第一階段，在質(zhì)體中完成。第二階段主要是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜上進(jìn)行，由ent-kaurene在KO和KAO的作用下生成GA12-7-醛，這也是GA的最初產(chǎn)物。據(jù)研究，GA12-7-醛可能是所有GA的前體，赤霉菌和高等植物前兩個階段合成過程是共有的。二者存在的一個區(qū)別是，前者的ent-kaurene合成有CPS和KS兩個酶分別催化，在赤霉菌中，是由單一的CPS/KS雙功能酶直接催化的。

在第三階段，由于不同的酶和底物作用形成許多不同的產(chǎn)物，在植物和真菌中也存在明顯區(qū)別。在植物中，該階段分為3條途徑：（1）早期的3-β羥基化途徑，發(fā)生在最后一步反應(yīng)中，由雙加氧化酶催化，由于它具有多功能性，植物體內(nèi)發(fā)生多種不同的反應(yīng)，不同赤霉素結(jié)構(gòu)的形成根據(jù)植物種類或植物組織不同而有所差異，而在赤霉菌中發(fā)生在信號通路的早期，有細(xì)胞色素P450單加氧化酶催化；（2）早期的13-β羥基化途徑；（3）早期的非3，13-羥基化途徑。GA20x是這一階段中非常關(guān)鍵的酶，因為它的底物專一性不強，對底物的親和力與C-13位是否羥基化有關(guān)。

要更好地利用赤霉素，那么了解它的合成途徑也是非常必要的。雖然現(xiàn)在有很多關(guān)鍵酶的基因已經(jīng)克隆出來，并且對途徑過程中調(diào)控也有很多學(xué)者進(jìn)行了研究，但是，仍然存在許多問題未解決。

4 赤霉素在植物中的分析及檢測

目前赤霉素的測定方法有很多種，主要有兩類[17]：一為生物法，如免疫法。其準(zhǔn)確度高，但是較復(fù)雜。二是理化測定法，如熒光比色法、氣相和液相色譜法等。

免疫法是一種取樣少， 靈敏度高的檢測法。最初建立的赤霉素免疫測定法靈敏度低，不能對生理水平的GA進(jìn)行定量測定[18]。之后建立了GAs放射免疫測定法(R1A) ，其取樣少，精度高，操作簡便，但是仍存在一些缺點，如有污染，費用高。1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。ELJISA分為直接法和間接法。黃少白、周燮等人將卵清蛋白(OVA)與GA4的復(fù)合物用于包板， 最早建立了GA 1，4 ，7間接ELlSA。熒光法是GA測定的經(jīng)典方法，但該法操作過繁，試劑消耗量大，且需要真空泵及冰浴等條件[17]。所以一般用于發(fā)酵法產(chǎn)赤霉素的測定。使用高效液相色譜(HPLC)對蔬菜中的農(nóng)藥GA殘留進(jìn)行分析檢測。用80％ 甲醇溶液作為提取劑；建立了液液萃取與SPE—PAK CI 8固相萃取相結(jié)合純化GA3的方法；檢測波長為206．00 nm，流動相為甲醇與7.5 mmol·L-1 甲酸水的體積比為3∶7的溶液；實驗結(jié)果表明，該方法是符合快速、可靠、靈敏、實用標(biāo)準(zhǔn)的GA，殘留分析檢測方法[19]。王駿等人運用液相色譜-質(zhì)譜法測定獼猴桃中赤霉素的含量，并證明該方法操作簡單，靈敏度高。

赤霉素作為植物的一類重要激素，值得我們對其更深的探索，希望通過對其研究改進(jìn)，能讓它為人類帶來更大的益處。

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收稿日期：2011-04-08；修訂日期：2011-07-04

基金項目：國家“十一五”重大專項轉(zhuǎn)基因生物新品種培養(yǎng)重大專項(2009ZX08003-019B)、(2008ZX08003-005)、(2008ZX08004-001)、(2009ZX08010-013B)

作者簡介：楊海蘭（1986-），女，天津人，在讀碩士生，主要從事玉米遺傳育種研究。通訊作者為季靜。