上、下坡跑臺運動對去卵巢小鼠骨組織IL-6、TNF-α和TRAP基因表達的影響

馬 濤，季 瀏，李世昌，孫 朋

上、下坡跑臺運動對去卵巢小鼠骨組織IL-6、TNF-α和TRAP基因表達的影響

馬 濤，季 瀏，李世昌，孫 朋

目的：以去卵巢手術小鼠模擬婦女絕經后骨質疏松癥狀，對比研究上、下坡跑臺運動對去卵巢小鼠骨組織IL-6、TNF-α和TRAP等細胞因子的影響。方法：32只8周齡C57 BL/6雌性小鼠隨機分為4組：假手術安靜組（SHAM），去卵巢安靜組（OVX），去卵巢上坡跑組（OVX+UP），去卵巢下坡跑組（OVX+DOWN）。SHAM組小實行去卵巢假手術，其余3組小鼠均摘除卵巢。訓練方案為：OVX+UP組進行上坡跑訓練，而OVX+DOWN組進行下坡跑訓練，每次40 min，每周訓練5次，共訓練8周。8周后取右側股骨提取mRNA，檢測其骨組織IL-6、TNF-α和TRAP等細胞因子的基因表達。結果：與SHAM組相比，OVX組小鼠骨組織IL-6、TNF-α和TRAP的基因表達顯著增加；兩運動組小鼠骨組織IL-6、TNF-α和TRAP的基因表達比OVX組小鼠顯著降低，且OVX+DOWN組比OVX+UP組的效果更明顯。結論：跑臺運動通過抑制去卵巢小鼠骨組織破骨細胞的分化和活化，從而有效預防骨質疏松癥的發生，且下坡跑運動比上坡跑運動效果更明顯；跑臺運動對去卵巢小鼠破骨細胞分化和活化的抑制作用可能與骨組織IL-6和TNF-α等細胞因子基因表達的變化有關。

跑臺運動；去卵巢小鼠；IL-6；TNF-α；TRAP

骨組織是一個不斷自我更新的組織，通過自我更新，骨組織可完成移除廢舊的骨組織、修復有創傷的部位以及適應變化的力學載荷等功能。骨組織的自我更新有賴于成骨細胞（OB）和破骨細胞（OC）進行骨形成和骨吸收。當骨形成大于骨吸收時則骨量增加，而當骨吸收大于骨形成時則骨量減少。在某些病理狀態下，成骨細胞或破骨細胞數量異常及功能紊亂，則發生骨量過分增加或減少的疾病，如骨形成功能亢進的骨硬化癥和骨吸收功能亢進的骨質疏松癥等。婦女絕經后骨質疏松癥就是由于絕經后雌激素的迅速下降引起的破骨細胞大量生成及活化導致的。破骨細胞來源于骨髓造血干細胞，在某些因素的刺激下，造血干細胞可向巨噬細胞分化、融合并最終形成破骨細胞。近年來的大量研究表明[1－2]，除了各種激素的作用之外，骨組織及骨髓局部的細胞因子對破骨細胞的分化及功能發揮具有重要作用。特別是近年來關于OPG－RANKL－RANK系統的研究更是將成骨細胞與破骨細胞之間的通訊之謎逐步揭開。骨組織及骨髓中成骨細胞、基質細胞、骨細胞及巨噬細胞等分泌的IL－6和TNF－α等細胞因子，可通過OPG－RANKL－RANK系統依賴及非依賴途徑促進破骨細胞的增值、分化及骨吸收功能的發揮。本研究利用去卵巢小鼠模型模擬婦女絕經后骨質疏松癥狀，通過對骨組織破骨細胞標志性酶抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的檢測，對比研究上、下坡跑臺運動對破骨細胞分化和活化的影響，并探討IL－6和TNF－α等細胞因子在絕經后破骨細胞分化過程中的作用及運動對它們的影響，對于深入揭示絕經后骨質疏松的發病機制及運動干預措施的選擇將具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級C57BL/6雌性小鼠32只，約8周齡，體重（20．26±2．13）g，（由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供）。動物購回后在本實驗中心動物房適應性喂養一周，然后隨機分為4組，即假手術安靜組（SHAM），去卵巢安靜組（OVX），去卵巢上坡跑組（OVX+UP），去卵巢下坡跑組（OVX+DOWN），每組8只。

1.2 去卵巢手術

動物以1%戊巴比妥鈉（0．1 g/kg）經腹腔麻醉后，剪除長毛，分別在脊柱兩側切開背肌1 cm切口，SHAM組小鼠行去卵巢假手術，僅去除卵巢周圍少量脂肪組織，其余3組小鼠均摘除卵巢，用可吸收的羊腸線縫合傷口，在傷口外涂少量紅霉素軟膏。

1.3 運動方案

SHAM組和OVX組在籠中正常飼養，沒有進行任何訓練；OVX+UP組和OVX+DOWN組于去卵巢手術后7天開始進行上坡跑或下坡跑訓練，訓練方案見表1。

表1 運動組小鼠訓練方案Tab.1 Training program of Exercise group

1.4 取材

于運動組小鼠最后一次訓練結束24h后，去眼球取血處死小鼠。取其右側股骨置于液氮中速凍，放于－80℃冰箱保存，待提RNA。

1.5 Real time PCR法測定骨組織IL-6、TNF-α和TRAP的基因表達

常規方法提取股骨總RNA，逆轉錄。根據所要檢測的目的基因，在NCBI數據庫查詢各基因引物序列，由上海生工生物技術有限公司進行引物合成，各基因引物序列及擴增長度為：IL－6：F 5′－GAACTCCCTCTCCACAAGC－3′，R 5′－TTCTTGTCAAGC AGGTCTCC－3′，擴增長度 325 bp；TNF－α：F 5′－GAGTCCGGGCA GGTCTACTTT－3′，R 5′－CAGGTCACTGTCCCAGCATCT－3′，擴增長度 235 bp；TRAP：F 5′－ TGA CAA GAG GTT CCA GGA －3′，R 5′－ AGC CAG GAC AGC TGA GTG －3′，擴增長度 312 bp；β－actin：F 5′－CAATTCCATCATGAAGTGTGAC－3′，R 5′－CCACA CAGAGTACTTGCGCTC－3′，擴增長度 184 bp。熒光定量 PCR 擴增反應按照以下體系進行，SYBR Premix Ex Taq TM（2×）10 μL、PCR Forward Primer（10 μm）0．4 μL、PCR Reverse Primer（10 μm）0．4 μL、ROX Reference Dye（50×）0．4 μL、DNA 模板 2 μL、加DEPC水使總反應體系達到20 μL。Real time PCR分3階段，擴增采用3步法進行，溫度循環參數如下：Stage 1（1×）：95 ℃，1 min（預變性）。Stage 2（40×）：95 ℃，15 s；61 ℃，30 s；72℃，45 s（收集熒光）。Stage3（1×）：建立 PCR 產物的熔解曲線，95℃，30 s；61℃，2 min；95℃，15 s；每 1℃收集熒光。反應結束后，PCR儀給出各反應孔的Ct值，以β－actin基因為內參，根據公式2－ΔCt計算各基因的相對表達量。

1.6 統計學方法

2 實驗結果

從圖1、圖2和圖3可以看出，OVX組小鼠骨組織IL－6、TNF－α和TRAP mRNA相對表達量顯著高于SHAM組小鼠（P＜0．01）；兩運動組小鼠骨組織 IL－6 、TNF－α 和 TRAP mRNA 相對表達量比 OVX組小鼠顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）；而兩運動組相比較，則OVX+DOWN組小鼠骨組織IL－6、TNF－α和TRAP mRNA相對表達量比 OVX+UP 組小鼠顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。

圖1 IL-6 mRNA的相對表達量Fig.1 The mRNA relative expression of IL-6注： **P＜0．01，代表與 SHAM 組比較；#P＜0．05 和 ##P＜0．01，代表與 OVX組比較；△P＜0．05 和△△P＜0．01，代表與 OVX+UP 組比較（下同）。

3 分析與討論

3.1 IL-6和TNF-α在骨代謝中的作用及去卵巢手術對其基因表達影響

圖2 TNF-α mRNA的相對表達量Fig.2 The mRNA relative expression of TNF-α

圖3 TRAP mRNA的相對表達量Fig.3 The mRNA relative expression of TRAP

骨組織中的IL－6主要由成骨細胞分泌，PKG可促使OB表達IL－6。IL－6與IL－3協同支持造血干細胞及破骨細胞前體的生長；IL－6也能增強其他細胞因子或激素對破骨細胞的作用，如增強PTHrP維持體內鈣平衡和調節破骨細胞骨吸收的作用。IL－1 和 TNF－α 能誘導成骨細胞產生 IL－6，IL－6 可與 PGE2協同作用通過OPG-RANKL-RANK系統來調節OC的分化。TNF-α是一種強有力的促進骨吸收的細胞因子，能誘導成骨細胞、基質細胞、T細胞、牙周韌帶細胞和滑膜細胞等表達RANKL，導致OC活化。TNF-α可通過RANKL依賴途徑或非RANKL依賴途徑直接誘導骨髓造血干細胞向OC的分化，IL-1對其誘導的OC吸收功能有顯著增強作用。TNF-α能直接刺激破骨細胞前體細胞的分化，同時刺激OB/ST產生M-CSF，促進破骨細胞的增值。另一方面，TNF-α誘導基質細胞產生M-CSF上調破骨細胞前體的RANK表達，從而通過RANKL與RANK的結合啟動OC的合成。白孟海等人的研究[3]發現，對去勢大鼠骨髓基質細胞進行體外培養，骨髓提取液IL-6、TNF-α含量升高，骨髓干細胞分化形成OC增加，且兩者的變化趨勢具有一致性。人體實驗亦取得相同結果，即絕經后骨質疏松婦女血清IL-6和TNF-α水平明顯高于絕經后非骨質疏松婦女，且IL-6和TNF-α水平與骨密度（BMD）呈負相關[4]。

骨是雌激素的重要靶器官之一，在成骨細胞、破骨細胞、骨細胞中均有雌激素受體（estrogen receptor，ER）存在。雌激素對骨骼的作用是通過對成骨細胞和破骨細胞的協同調節完成的。雌激素既可以作用于成骨及破骨細胞表面的受體直接影響骨形成和骨吸收，也可以通過這些細胞分泌局部調節因子或調節這些細胞對局部調節因子和全身激素的反應性來影響骨代謝。絕經后骨質疏松癥的主要發病機制是機體的骨重建失衡。絕經后由于體內雌激素的迅速下降，導致機體的多種激素及細胞因子發生改變，使破骨細胞大量分化和融合，骨吸收大于骨形成，從而導致骨質疏松癥。雌激素可在基因水平抑制TNF-α、IL-1、IL-6等骨吸收因子表達，增加TGFβ等成骨因子表達，進而啟動破骨細胞凋亡，預防骨丟失，雌激素可以促進OPG的表達，抑制M-CSF的分泌[5]，由于M-CSF是破骨細胞增殖的重要因子，因此雌激素缺乏后的突出表現是破骨細胞的數量增多，骨吸收功能增強。

本研究的結果顯示，OVX組小鼠與SHAM組小鼠相比，骨密度顯著下降同時骨組織中IL-6和TNF-αmRNA的相對表達量顯著升高，表明在去卵巢小鼠骨質疏松的發生過程中，骨組織中IL-6和TNF-α等細胞因子的變化起到了一定的作用。小鼠去卵巢手術后，體內雌激素水平迅速下降，致骨組織中成骨細胞、基質細胞、骨細胞及巨噬細胞等分泌的IL-6和TNF-α等細胞因子發生變化，并通過OPG-RANKL-RANK系統依賴或非依賴途徑促進骨髓造血干細胞向破骨細胞的分化以及破骨細胞的增殖、分化，提高成熟OC的活性，促進骨吸收，最終導致骨密度下降，骨質疏松癥的發生。

3.2 上、下坡跑臺運動對去卵巢小鼠骨組織IL-6和TNF-α基因表達的影響

運動訓練對于骨代謝的影響，主要是通過骨組織受到的應力、激素的分泌、以及運動造成營養吸收的改變等方面來發揮作用的，其中骨組織在運動過程中受到的應力對骨代謝的影響作用最明顯[6-7]。骨組織在運動過程中受到地面的反作用力以及骨骼肌施加的各種應力，骨細胞感受到這種應力，通過機械-化學偶聯將機械信號轉變為化學信號來發揮作用。遍布于整個骨陷窩-骨小管網絡的骨細胞是骨的初級機械感應細胞，骨細胞通過間隙連接與骨表面細胞和臨近骨細胞保持聯系，他們對機械刺激的反應是加快代謝、激活基因和產生生長因子和基質[8-9]。機械信號轉化為化學信號是多個信號轉導途徑的共同結果，在骨細胞膜或細胞骨架水平被激活[10]。切應力激活G蛋白偶聯的機械刺激感受器，引起胞內鈣、前列腺素（Prostaglandin，PG）和一氧化氮水平的提高。一氧化氮和前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）作為中間信號，參與將機械信號轉化為生化信號過程，引起機體多種激素和細胞因子發生變化，這些激素和細胞因子相互調節并構成一個復雜的網絡系統，最終直接或間接地通過OPG-RANKL-RANK系統調控骨代謝[11]。Saunders等人的研究表明應力（混合應力）作用于成骨細胞后，促進OPG表達，對RANKL的表達無顯著影響[12]。應力還可以調節成骨細胞分泌巨噬細胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor，M-CSF），參與破骨細胞的分化與成熟[13-14]。一次性力竭運動后，血漿中骨代謝相關細胞因子水平均發生顯著變化，特別是IL-6、IL-10、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）[15]。一次性大強度運動還可以提高運動員血清TGF-β的水平[16]。

在本研究中，兩運動組與OVX組相比，IL-6和TNF-α mRNA的相對表達量都顯著下降，這表明跑臺運動對骨組織起到了較好的刺激作用，骨組織在運動過程中受到了較理想的應力，通過機械-化學偶聯將機械信號轉變為化學信號，使骨組織及骨髓微環境中IL-6和TNF-α等骨吸收促進因子基因表達降低，從而改善了雌激素缺乏導致的骨代謝失衡，部分阻止了骨量的下降。兩運動組之間相比較，則OVX+DOWN組比OVX+UP組IL-6和TNF-α基因相對表達量顯著降低，表明在改善雌激素缺乏引起的骨代謝失衡方面，下坡跑運動比上坡跑運動的效果更顯著。

3.3 上、下坡跑臺運動對去卵巢小鼠骨組織TRAP基因表達的影響

婦女絕經后骨質疏松癥就是由于絕經后雌激素的迅速下降引起的破骨細胞大量生成及活化導致的。破骨細胞來源于骨髓造血干細胞，在某些因素的刺激下，造血干細胞可向巨噬細胞分化、融合并最終形成破骨細胞。從造血干細胞到破骨細胞的分化過程可知，造血干細胞首先分化為單核的巨噬細胞，單核的巨噬細胞在M-CSF和RANKL的的作用下，逐漸聚集、融合，并最終形成多核的破骨細胞，多核的破骨細胞在沒有完全成熟的情況下，并不具有骨吸收功能，要成為成熟并具有骨吸收功能的破骨細胞，還需要經歷核的極化以及特殊形態結構的出現等過程[17]。成熟的破骨細胞膜形成兩種特有的結構，根據其形態學特征，分別稱為絨毛緣和透亮區。絨毛緣是指高度皺褶呈指樣伸向骨表面的質膜復合結構，其功能是通過釋放蛋白酶原和氫離子，進而引起骨基質的吸收和降解。透亮區環形包繞絨毛緣區域，將吸收區與非吸收區分開，故也稱封閉區[18]。除了形態學的標志之外，成熟的破骨細胞分泌的一些特殊的酶也可作為其標志性酶，如 TRAP 和金屬蛋白酶（MMP-9）等[19]。

未成熟的破骨細胞及破骨細胞前體都不分泌TRAP，只有成熟的具有骨吸收作用的破骨細胞才會分泌TRAP，因此，通過檢測TRAP的基因表達可以間接的反映各組小鼠骨組織破骨細胞生成和活化的情況。本研究的熒光定量PCR結果顯示：去卵巢手術可導致破骨細胞大量分化并活化，而跑臺運動可以有效抑制破骨細胞的分化和活化，且下坡跑運動優于上坡跑運動。

通過對比研究上坡跑運動與下坡跑運動對去卵巢小鼠骨組織IL-6、TNF-α和TRAP基因表達的影響，本研究發現上、下坡跑臺運動對去卵巢引起的破骨細胞分化和活化有較好的預防作用，且下坡跑運動比上坡跑運動具有更好的效果。究其原因，主要是上坡跑運動和下坡跑運動在運動時對于骨的力學刺激不同。下坡跑運動每一步跑動在下落過程中所克服的垂直方向的沖量比上坡跑運動大，其骨組織所受到的地面應力也比上坡跑運動大。此數據結果與原因分析在本實驗室前期已發表論文中已有闡述[20]，這里就不再詳細展開。另外，此結果和本實驗室前期有關縱跳運動對于骨密度的影響的研究結果相吻合[21-22]。

4 結 論

（1）跑臺運動通過抑制去卵巢小鼠骨組織破骨細胞的分化和活化，從而有效預防骨質疏松癥的發生，且下坡跑運動比上坡跑運動效果更明顯。（2）跑臺運動對去卵巢破骨細胞分化和活化的抑制作用可能與骨組織IL-6和TNF-α等細胞因子基因表達的變化有關。

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Effect of Uphill or Downhill Running on Gene Expression of IL-6，TNF-α and TRAP in Bone of Ovariectomized Mice

MA Tao，JI Liu，LI Shichang，SUN Peng
（School of PE and Health，East China Normal University，Shanghai 200241，China）

Objective：Through surgical simulation in ovariectomized mice to women with postmenopausal osteoporosis，the effect of uphill and downhill running on gene expression of IL-6，TNF-α and TRAP in ovariectomized mice was studied.Method：32 8-week-old C57 BL/6 female mice were randomly divided into 4 groups：sham operation group（SHAM），ovariectomized group（OVX），uphill running group（OVX+UP）and downhill running group（OVX+DOWN）.SHAM group mice were sham ovariectomized，and the remaining three groups of mice were ovariectomized.The rats of OVX+UP group were trained to do uphill running training which last a total of 8 weeks，the rats of OVX+DOWN group were trained to do downhill running training which last a total of 8 weeks，40 minutes each training，5 times a week.After 8 weeks，the mRNA was extracted from the right femur and the gene expressions of IL-6，TNF-α and TRAP were detected.Results：Compared with the SHAM group，the gene expression of IL-6，TNF-α and TRAP in local bone tissue of the OVX group were significantly increased.The gene expression of IL-6，TNF-α and TRAP in local bone tissue of the exercise groups were significantly decreased compared with the OVX group.OVX+DOWN group was better than OVX+UP.Conclusion：Through inhibiting osteoclast differentiation and activation in bone of ovariectomized mice，treadmill exercise can effectively prevent the occurrence of osteoporosis，and the inhibiting effect of downhill running is bigger than that of uphill running.The inhibiting effect to osteoclast differentiation and activation of treadmill exercise may be related to the changes in gene expression of IL-6，TNF-α and TRAP in bone.

treadmill exercise;ovariectomized mice;IL-6;TNF-α;TRAP

G 804.22

A

1005-0000（2011）03-0204-04

2010-12-16；

2011-04-06；錄用日期：2011-04-08

教育部重點實驗室開放課題基金

馬 濤（1979-），男，山東菏澤人，講師，在讀博士研究生，研究方向為骨組織運動適應的生物學機制。通訊作者：季 瀏（1961-），男，江蘇泰興人，教授，博士生導師。

華東師范大學體育與健康學院，上海200241。