乳清蛋白的酶法改性研究

李 慧 石金波劉小翠

（1山西大同大學農學與生命科學學院，大同 037009） （2山西省農科院高寒區作物研究所，大同 037008）

·基礎研究·

乳清蛋白的酶法改性研究

李 慧1*石金波2**劉小翠1

（1山西大同大學農學與生命科學學院，大同 037009） （2山西省農科院高寒區作物研究所，大同 037008）

采用堿性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶在各自的最適條件下對乳清蛋白粉進行水解，通過HPLC方法測定酶解產物中α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg）的含量。結果表明，堿性蛋白酶對其水解最快，其次為木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下則不易酶解，而且發現α-La比β-Lg更容易水解。

乳清蛋白；α-乳白蛋白；β-乳球蛋白；酶解；高效液相色譜

乳清蛋白（Whey Protein） 是牛奶中的一種主要蛋白質，其含量僅次于酪蛋白，占牛奶中蛋白質質量的18%～20%。其中β-乳球蛋白（β-Lg）和α-乳白蛋白（α-La）是乳清蛋白的主要成分，分別占其質量的40%～50%和10%～20%左右。乳清蛋白具有較高的營養價值及功能特性，一直以來被廣泛的應用于食品工業。但乳清蛋白又是一種常見的過敏原，其中β-乳球蛋白是引起牛乳過敏的主要成分，其次為α-乳白蛋白。目前主要通過蛋白質改性的方法來控制和消除乳清蛋白過敏原。

蛋白酶催化乳清蛋白水解是降低過敏反應的一種有效的方法。蛋白酶通過水解乳清蛋白的抗原決定部位，可以消除或降低其抗原性，降低牛乳過敏反應。同時可以產生一系列具有生物活性的肽，還能改善其功能特性，促使營養組成更趨合理、風味更為突出。水解產物可作為食品原料或添加輔料應用于營養配方食品、保健品、療效食品、臨床營養品、速溶飲品及方便食品，從而拓寬蛋白質應用范圍，提高蛋白質使用價值，還可滿足消化道蛋白酶分泌不足患者、老年人、運動員、肥胖癥患者、嬰兒等特殊人群需要。

本文采用幾種最常用的蛋白酶水解乳清蛋白，通過HPLC方法測定水解產物中α-La和β-Lg含量，以這兩種蛋白的水解速率為指標，篩選出最快酶解α-La和β-Lg這兩種過敏原的酶作為最佳用酶，為牛乳蛋白過敏患者尤其是嬰幼兒過敏患者開發低過敏或無過敏的乳蛋白制品提供方法和理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

乳清蛋白粉（WPC 80），蛋白質質量分數為72.8%,水分質量分數為6.1%，美國Proliant公司；堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L），諾維信公司；木瓜蛋白酶 （Papain 18），廣州遠天；風味蛋白酶（Flavourzyme 500MG），諾維信公司；中性蛋白酶，Amresco公司；復合蛋白酶（Protamex），諾維信公司；胰蛋白酶（trypsin）、胃蛋白酶（pepsin），sigma公司；L-酪氨酸，BDH Chemicals Ltd Poole England。

1.2 儀器與試劑

Sartorious電子分析天平，德國；THZ-82恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；DYCZ-24D雙垂直電泳槽、DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；高效液相色譜儀（SPD-M10AVP），日本島津公司；752紫外光柵分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；792-雙向磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市醫療儀器廠；pHS-25型pH計，上海精科雷磁。

β-乳球蛋白標準品、α-乳白蛋白標準品、色譜純乙腈，sigma公司；三氟乙酸，北京津益化工廠。

硼砂、硼酸、氫氧化鈉、乳酸、乳酸鈉、甲醛均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白水解工藝流程

選取堿性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶7種蛋白酶在各自最適的條件下進行水解，水解條件見表1。

表1 水解用酶的最適反應條件

稱取一定量的乳清蛋白粉，根據各種酶的最適pH，選取不同的緩沖液做溶劑配置成質量濃度為80 g/L的乳清蛋白粉溶液加入反應容器中。達到酶解溫度后，按照1 000 U/g加入相應的酶，在最適條件下水解30 min。反應在恒溫水浴振蕩器中進行。反應到終點用1 mol/L的HCl調節pH到2，鈍化酶。胃蛋白酶水解終點時加1 mol/L的NaOH調節pH到12使酶失活。

1.3.2 測定方法

HPLC法測定α-La和β-Lg的條件：Kromasil C8反相色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相為A：體積分數0.1%的TFA水溶液，B：體積分數0.09%的TFA乙腈溶液梯度洗脫。流動相B在10 min內從20%上升到50%，然后用10 min從50%上升到80%，在2 min內由80%降到20%。流速為0.8 mL/min；二極管陣列檢測器，檢測波長：215 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

水解度的測定采用甲醛滴定法。

蛋白酶活力的測定采用紫外分光光度法。

α-La和β-Lg酶解率計算方法：

式中：m1——酶解前的含量；

m2——酶解后的含量。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶活力的測定

測得各蛋白酶的活力見表3。酶活是反應酶水解底物的能力，本試驗對各種蛋白酶的考察均按相同的酶活力加酶，即在相同的條件下考察了各種蛋白酶對α-La和β-Lg的水解能力。

表2 蛋白酶酶活力

2.2 不同蛋白酶水解物中α-La和β-Lg的含量

用HPLC方法分析了各種蛋白酶的酶解產物。圖1為樣品未酶解的HPLC圖譜，圖2是胃蛋白酶的酶解圖譜，其他酶解圖譜略。比較酶解前后的圖譜可以看到，乳清蛋白粉經過酶解后，α-La和β-Lg的含量比酶解前降低，而且在α-La和β-Lg的峰前產生許多小峰，說明酶解后產生了大量的肽段。

圖1 樣品的高效液相色譜圖

圖2 胃蛋白酶酶解樣品的高效液相色譜圖

通過HPLC方法測定了各種蛋白酶在其最適條件下酶解后水解物中α-La和β-Lg的含量。經過計算得出其酶解率，結果見圖3。

由圖3可以看出，除胃蛋白酶外，其他6種酶對α-La的酶解率都為100%；而只有堿性蛋白酶將β-Lg徹底酶解，其余均未完全酶解?？芍?La比β-Lg更容易水解。對于β-Lg，堿性蛋白酶對其水解最快，其次為木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下β-Lg不易酶解。因此，本試驗選擇堿性蛋白酶為最適用酶，該酶是一種微生物蛋白酶，來源廣泛、活力比較高、水解速度快、成本低，是較理想的工業用酶。而且該酶為液體酶，容易與底物充分作用。

圖3 不同蛋白酶作用下α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的酶解率

乳清蛋白酶解的速率主要與其結構有關，乳清蛋白由于具有二硫鍵，不易被消化酶即胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，乳清蛋白的不易消化性是造成其容易引起過敏的原因。堿性蛋白酶則是內肽酶，主要催化由疏水性氨基酸的羧基形成的酰胺鍵，可水解蛋白質分子內部的肽鍵，生成相對分子質量較小的多肽，因而能破壞蛋白質分子內部的抗原結合位點，有效降低蛋白的過敏原性。本試驗的研究結論與前人研究結果一致。Mota等人曾比較了胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶對乳清蛋白粉中β-Lg和α-La的水解速率，結果表明堿性蛋白酶速率最高。Wroblewska等發現可以利用堿性蛋白酶水解乳清蛋白，降低乳清蛋白的抗原性，以此來制備低致敏牛奶。沈小琴等人比較了幾種不同酶水解乳清蛋白，發現堿性蛋白酶降低乳蛋白抗原性的效果最佳。

2.3 不同蛋白酶水解物的水解度

本試驗采用甲醛滴定法測定不同蛋白酶水解物的水解度，結果見圖4。

圖4 不同蛋白酶水解物的水解度

由圖4可以看出，堿性蛋白酶水解物的水解度最大，表明堿性蛋白酶水解能力最強；其次為木瓜蛋白酶；胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解度最小。以水解能力作為選擇蛋白酶的評價指標時，應選擇堿性蛋白酶，因其水解能力最強，酶的反應速度快，能滿足實際生產的要求。但在采用堿性蛋白酶水解乳清蛋白過程中多采用限制性酶解，即在使α-La和β-Lg水解的前提下，要盡量控制其水解度，主要原因是蛋白質充分酶解不僅會使成本增加，而且酶解產物的風味變差。蛋白質充分酶解后形成的游離氨基酸吸收比多肽的吸收差，而且影響產物的功能特性，使其乳化性及穩定性變差。

3 結論

本試驗采用堿性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶7種蛋白酶水解乳清蛋白粉，通過HPLC法定量測定，比較了不同種類的蛋白酶在其最適條件下酶解乳清蛋白后，酶解產物中α-La和β-Lg的含量。試驗結果表明：α-La比β-Lg更容易水解；7種蛋白酶中堿性蛋白酶對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白水解最快，其次為木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下則不易酶解。最終篩選出堿性蛋白酶作為水解β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的最適用酶。

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Study on the enzymatic modification ofwhey protein

LI Hui1*SHI Jin-bo2**LIUXiao-cui1
1（College ofagriculture and life science，Shanxi Datonguniversity，Datong037009，China）2（High latitude crops institute toShanxi academyofagriculture science，Datong037008，China）

Whey protein concentrate（WPC）were hydrolyzed by seven proteases respectively,they were alcalase,papain,flavourzyme,protamex,neturase,pepain and trypsin.The degradation of α-Lactalbumin（α-La）and β-Lactoglobulin（β-Lg）were determined by HPLC.Results indicated alcalase was observed to be the fastest degradation of α-La and β-Lg.The second was papain.Pepain and trypsin hydrolysis rate was slow.α-La hydrolyzed easier than β-Lg.

whey protein； α-Lactalbumin；β-Lactoglobulin；proteolysis；HPLC

TS252.42

A

1673-6004（2011）04-0043-04

*李慧，女，1981年出生，2006年畢業于中國農業大學食品科學專業，助理工程師。

**石金波，通訊作者：Email：shijinbo2009@163.com.

2011-07-05