釀酒酵母純化低聚半乳糖

潘彬也，高艷玲，歐陽夷，張少輝

（上海交通大學a.農業與生物學院；b.陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

釀酒酵母純化低聚半乳糖

潘彬也a，高艷玲a，歐陽夷a，張少輝b

（上海交通大學a.農業與生物學院；b.陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

使用β-乳糖酶制得含低聚半乳糖的混合溶液，添加4種釀酒酵母對其使用微生物法純化，采用脈沖安培檢測器與高效陰離子交換色譜結合法對結果進行分析。結果表明，實驗組中低聚半乳糖純度均有明顯提高，其中釀酒酵母GIM 2.91效果尤為顯著，將低聚半乳糖純度從對照組的30.76%提高至39.52%，升幅達28.48%。

低聚半乳糖；純化；釀酒酵母

0 引 言

低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharides，簡稱GOS）是一種功能性低聚糖，能改善腸道微生態平衡、防止便秘等[1-4]。酶法制備低聚半乳糖被廣泛采用[5，6]。但產物中大量雜糖的存在掩蓋了其功能特性，如葡萄糖會其會嚴重干擾其生理功能[7]。

目前低聚糖分離提純的方法主要有色譜柱分離法[8]、膜分離法[9]、酶法[10]和微生物發酵法[11]。 其中微生物發酵法對設備要求低，分離周期短且能耗相對較低[12]。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Hansen）可將葡萄糖葡萄糖、半乳糖等單糖吸入細胞內，酶解其為二氧化碳和酒精[13]。本工作擬用該微生物菌株作用于酶法制備的低聚半乳糖混合溶液，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測器檢測反應前后低聚半乳糖的純度變化，為今后研究單一組分低聚半乳糖的結構與功能特性打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微生物菌種由廣東省微生物菌種保藏中心提供：釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Hansen（編號GIM 2.34）；橢圓釀酒酵母Saccharomyces cervisiae Hansen var.ellipsoideus（Hansen）Dekker（編號GIM 2.91）；釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Hansen（編號GIM 2.92）；釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Hansen（編號GIM 2.95）。

乳糖酶β-Galactosidase[14]（米曲霉）。

1.2 儀器與設備

DX-600型離子色譜儀（配有GP50梯度泵），戴安中國有限公司；ED50電化學檢測器（金工作電極、Ag/AgCl參比電極），戴安中國有限公司；Chromeleon色譜工作站，戴安中國有限公司；CarboPacTMPA-1分析柱（4 mm×250 mm），戴安中國有限公司；CarboPacTMPA1保護柱（4 mm×50 mm），戴安中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法制備含低聚半乳糖溶液

制備5瓶100 mL體積分數為32%的乳糖溶液，經121℃下高壓滅菌15 min，溶液冷卻后加入質量分數為1‰乳糖酶，在適宜溫度下培養24 h后滅活。

1.3.2微生物法處理

將微生物菌種接種于適當的培養基中培養各兩管，其中一管劃平板，若菌種單一且長勢良好，則保留另一管以待添加。向制得的5瓶低聚半乳糖底物溶液中添加等量四種釀酒酵母，在各菌的最適溫度下反應24 h后滅活，留一瓶不作處理，作為空白對照。

1.3.3 樣品的預處理

使用纖維素膜（0.22 μm）過濾樣品溶液，除掉乳糖溶液可能對分析柱、檢測器等產生污染和干擾的大分子物質，再用疊氮化鈉溶液稀釋10 000倍后送檢。

1.3.3 低聚半乳糖的檢測

采用離子色譜法，配合四電位脈沖安培檢測器，利用混合溶液梯度淋洗，對GOS進行檢測[15～18]。檢測條件：流速1 mL/min,檢測溫度室溫，進樣體積20 L，采用梯度洗脫法，通34.475 kPa氮氣檢測，積分脈沖安培4電位波形檢測法，其檢測電壓分別為：E1=+0.10 V，E2=-2.00 V，E3=+0.60 V，E4=-0.10 V。

1.4 色譜圖計算

對比對照組的色譜圖，確定實驗組中各峰成分。按以下公式計算出該成分質量分數[19]。將對照組與實驗組成分質量分數進行對比。

每組結果中，低聚糖峰的數量為低聚糖的種類數，所有低聚糖量的疊加為其低聚半乳糖總量，對比各組低聚半乳糖質量分數與轉化率，進而分析實驗結果。

2 結果與分析

預處理后的空白對照組樣品色譜圖如圖1所示。同時對相同預處理條件下的4組實驗樣品進行檢測，待繪制出色譜圖及色譜參數后，以標準物色譜峰為根據進行定性與定量分析，以GIM 2.91為例，色譜圖如圖2所示。

圖1中，對應色譜峰出峰時間：1為半乳糖9.00 min；2為葡萄糖10.20 min；3,4為3-α-半乳二糖類16.93 min和19.92 min；5為乳糖20.48 min；6為異構別乳二糖類23.50 min；7,8為三聚半乳二糖類24.82 min和26.20 min；9～12為四聚半乳二糖類28.65，29.63，33.07，34.70 min。

根據對照組色譜圖確定樣品色譜峰的成分，如圖2確定峰1、峰2、峰5分別為半乳糖峰。葡萄糖峰和乳糖峰，介于葡萄糖峰與乳糖峰間的峰為3-α-半乳二糖類，乳糖峰后，24 min之前的成分為異構別乳二糖類，24 min到27 min間為三聚半乳二糖類，之后為四聚半乳二糖類。兩圖對比，可見峰的形狀相似，但實驗組釀酒教母GIM 2.91的低聚糖峰數目增加，面積也相對增大。確定峰的成分后，根據1.4中色譜圖計算方法對各峰進行定量分析。

圖2中，對應色譜峰出峰時間：1為半乳糖8.97 min；2為葡萄糖10.17 min；3,4為3-α-半乳二糖類16.85 min和19.90 min；5為乳糖20.50 min；6,7為異構別乳二糖類21.40 min和23.50 min；8,9為三聚半乳二糖類24.87 min和26.25 min；10～13為四聚半乳二糖類28.02，28.75，29.75，33.27 min。

經過對色譜儀原始數據表格的分析計算，得出低聚半乳糖溶液空白對照組與各實驗組的各項參數如表1所示。并根據此結果對實驗進行分析。

表1 各組樣品低聚半乳糖量檢測結果g

為更加直觀地觀察實驗組與空白組的區別，擬將各組樣品的單糖量（葡萄糖、半乳糖）進行對比，結果如圖3所示；將各組樣品中低聚半乳糖占總糖比例，即低聚糖純度進行對比，結果如圖4所示。

由圖3可以看出，添加釀酒酵母能明顯降低樣品中的單糖量，葡萄糖量由空白組的9.51 g降至7.77 g至7.07 g不等，半乳糖量由5.07 g降至4.30 g至3.50 g不等。其中釀酒酵母GIM 2.91（橢圓釀酒酵母Saccha-romycescervisiaeHansenvar.ellipsoideusHansen Dekker）的發酵作用最佳，將葡萄糖量減少至7.07 g，幅度達25.66%；半乳糖量降至3.50 g，降幅30.97%；單糖總量14.58 g降至10.57 g，降幅27.50%。

圖3中，每實驗組第1列柱形代表單糖總量，第2列代表葡萄糖總量，第3列代表半乳糖總量。

正由于釀酒酵母對單糖的發酵作用，樣品中的低聚半乳糖的相對量大大提高（圖4）。其中發酵能力最強的釀酒酵母GIM 2.91，將低聚半乳糖在總糖中所占比例由空白組的30.76%提高至39.52%，提高近9個百分點，效果非常明顯。

提高低聚糖純度的同時，添加釀酒酵母也豐富了低聚半乳糖的種類。菌種GIM 2.92及GIM 2.95讓低聚半乳糖的種類由原先的9種增加為11種（表1）。推測是微生物體內豐富的酶類催化了低聚糖的結構異化反應，有待研究。

3 結 論

低聚半乳糖作為一種功能性食品，是食品科學領域的研究熱點。酶法制備低聚半乳糖的產物為葡萄糖、半乳糖、乳糖及GOS的混合物，但其中大量雜糖的存在掩蓋了其功能特性。向酶法制備的低聚半乳糖底物溶液中添加4種釀酒酵母，采用離子色譜-脈沖安培檢測器對產物進行檢測，結果證明了釀酒酵母對單糖的發酵分解能力，其中菌種GIM 2.91的發酵能力尤為顯著，將單糖總量降低了27.50%，從而大大提高了樣品中的低聚半乳糖的相對質量分數，低聚半乳糖比例由空白組的30.76%提高至39.52%。同時，釀酒酵母的加入豐富了低聚半乳糖的種類，具體原因有待進一步研究。

實驗證明釀酒酵母法可在一定程度上對酶法制備的低聚半乳糖溶液進行純化，減少單糖對檢測的干擾，為今后單一組分低聚半乳糖的結構與功能特性研究打下基礎。

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Galacto-oligosaccharide purification by Saccharomyces cerevisiae Hansen

PAN Bin-yea,GAO Yan-linga,OUYANG Yia,ZHANG Shao-huib
（Shanghai Jiaotong University a.College of Agriculture and Biology;b.Bor S.Luh Food Safety Research Center,Shanghai 200240,China）

Add four kinds of saccharomyces cerevisiae hansen to galacto-oligosaccharide（GOS）mixture made by β-galactosidase and analyze the results with high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector（HPAEC-PAD）.The results show significant improvement of galacto-oligosaccharide purity,especially when treated by saccharomyces cerevisiae hansen GIM 2.91.Saccharomyces cerevisiae hansen GIM 2.91raises the purity of galacto-oligosaccharide by 28.48%,from 30.76%to 39.52%.

galacto-oligosaccharide；purification；saccharomyces cerevisiae Hansen

Q93-33

A

1001-2230（2011）08-0008-03

2011-05-09

國家“863”計劃項目（2008AA10Z329）。

潘彬也（1988-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

張少輝