風味酶水解乳清蛋白生產蛋白胨的工藝條件

石丹，王彩云，云戰友，高海燕

（1.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，呼和浩特 010080；2.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特 010018）

風味酶水解乳清蛋白生產蛋白胨的工藝條件

石丹1，王彩云1，云戰友1，高海燕2

（1.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，呼和浩特 010080；2.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特 010018）

為了提高原料乳清蛋白（WheyProteinConcentrate，WPC）的產品附加值，利用風味蛋白酶對WPC進行水解，生產蛋白胨產品。結果表明：最優工藝條件為E/S（18 000 U/100 mL），溫度為55℃，pH值6.0，水解時間為4.0 h，底物質量分數為8%，水解度為46.4%。利用此工藝生產的蛋白胨產品在理化指標、氨基酸組成及質量分數上均要好于市售的同類產品。

乳清蛋白；水解度；風味蛋白酶；蛋白胨

0 引 言

近年來，中國乳品企業承受著國際國內需求不斷升級和市場原材料價格普遍上漲的壓力，因此，如何在乳品成本壓力驟升、盈利能力下降的行業背景下提升乳品企業的競爭力，已經成為每個乳品企業急需解決的問題。這就需要突破傳統的乳品研發概念，依靠科技進步，調整乳制品結構，不斷進行產業升級，探索乳在食品行業之外的應用，開發出高附加值的產品。

本研究以乳品企業的大宗原料產品乳清蛋白為主要原料，利用風味蛋白酶進行水解，并確定最優的水解工藝條件，生產價值更高的蛋白胨類產品[1-5]。本工藝研究不僅可以為乳品原料找到新的利用價值，同時還可以解決部分不合格奶或者是過期奶的問題，應對突發危機，提升廢物利用價值，同時本研究還可以為開發功能性活性肽，如酪蛋白磷酸肽、降血壓肽，降血糖肽等探索新的思路[6-10]。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

風味蛋白酶（F 1000L）測得活力為12 316.96 U/g；WPC；其他試劑均為優級純或分析純。

1.2 儀器與設備

756PC型紫外可見分光光度儀，BP211D型電子天平，LSHZ-300型冷凍水恒溫振蕩器。

1.3 測定方法

酶活力測定采用紫外分光光度法測定蛋白酶的活力[11，12]；水解度的測定采用三硝基苯磺酸鈉（TNBS）法[13，14]。

1.4 方法

1.4.1 酶濃度與底物溶液濃度比值的選擇

乳清蛋白溶液的質量分數8%，溫度為55℃、pH值為7.0，分別在E/S為40.00，60.00，80.00，100.00，120.00，140.00，160.00，180.00，200.00 U/mL條件下水解2 h，測定其水解度，找出最適E/S。

1.4.2 酶解溫度的選擇

乳清蛋白溶液的質量分數8%，pH值為7.0，E/S為2.2中確定的最適條件，分別在45℃、50℃、55℃、60℃和65℃條件下水解2 h，測定其水解度，找出最適酶解溫度。

1.4.3 酶解pH值的選擇

乳清蛋白溶液的質量分數為8%，溫度為文中2.2.2選定的最佳溫度，E/S為1.4.1中確定最適條件，pH值分別為5.0，6.0，7.0，8.0和9.0，水解2 h，測定其水解度，找出最適pH值。

1.4.4 酶解時間的選擇

按以上選定的最佳參數，分別水解2，2.5，3，3.5，4 h；測定其水解度，找出最佳酶解時間。

1.4.5 滅酶活

水解液在沸水浴中保持10 min，可使風味蛋白酶結構發生變化，達到不可逆失活的效果。

1.4.6 酶解最優工藝條件的確定

以水解度為考察指標，對水解條件進行優化，確定酶解的最佳工藝。對酶濃度與底物溶液濃度比（E/S）、水解溫度（℃）、pH值、反應時間（h）進行四因素三水平正交實驗。因素和水平排列如表1所示。

表1 正交實驗因素水平

2 結果與分析

2.1 酶濃度與底物濃度最佳比值的確定

酶濃度與底物溶液濃度（E/S）之比，比酶濃度本身能更好地反映酶解過程中的反應速度特征。當底物濃度一定，而增加的酶量又未使底物濃度飽和時，則E/S越大，反應速度也越快，蛋白質的水解率也越高。但E/S過大，生產成本也相應提高，同時，也有可能導致酶自身相互水解，使酶活力降低。結果如圖1所示。

由圖1可知，水解度隨E/S的增大而增大，但E/S＞160.00 U/mL時，酶解率增加不明顯，考慮到生產成本問題，選擇E/S為180.00 U/mL較為合適。

2.2 最適酶解溫度的確定

在蛋白質酶解過程中，溫度對酶解反應效率的影響包括兩個方面，即蛋白酶催化反應速度及蛋白酶的穩定性。在一定范圍內升高溫度，底物轉變成產物的速度加快，酶解效率也相應提高。溫度過高，酶蛋白變性，酶的穩定性下降，酶解效率隨之降低。分別在45，50，55，60和65℃時測定風味蛋白酶水解WPC后的水解度，結果如圖2所示。

由圖2可以看出，55℃時，水解度最高；55℃后，由于風味蛋白酶的穩定性下降，酶被鈍化，使酶解率降低。故選定55℃為最適酶解溫度。

2.3 酶解最佳pH值的確定

pH值對酶催化反應的影響包括兩個方面，即影響酶的穩定性以及酶催化底物轉變成產物。分別在pH 5.0，6.0，7.0，8.0和9.0的條件下測定酶解液的水解度，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，在不同pH值下，蛋白酶對WPC的水解作用不同。當pH值為6.0時，酶解液的水解度最高；pH值低于或高于6.0時，酶穩定性減弱，酶活降低，酶解率下降。因此，風味蛋白酶水解WPC的最適pH值為6.0。

2.4 酶解時間的確定

酶解時間主要依據酶解產物的分子量分布，原則上酶解時間越長酶解產物中游離氨基氮的質量分數及短肽的質量分數越高，但要考慮生產成本，如果產品達到相關檢測指標之后，即可終止酶解過程。不同酶解時間對水解度的影響如圖4所示。

實驗結果表明，當酶解時間為4h時，酶解產物中游離氨基氮的質量分數最多，符合要求。故選定酶解時間為4 h。

2.5 正交實驗

通過單因素實驗，可以得到各因素的最佳值，從而確定每個因素的最佳使用區域，再進行正交實驗，水解度結果如表2所示。

表2 L9（34）正交設計方案及實驗結果

可以根據極差R的大小來確定各因子影響指標的主次順序。由表2可以看出，各因子的極差R的大小依次為B＞C＞A＞D，因此各因素的影響排列順序依次為溫度＞pH值＞E/S＞時間。

通過對表2和圖5數據的比較分析，并對生產成本的綜合考慮，確定風味蛋白酶酶解WPC的最優工藝條件為A2B2C2D2，即：E/S為180.00 U/mL，溫度為55℃，pH值為6.0，時間為4.0 h。

3.6 蛋白胨產品的分析

利用此酶解工藝條件制得的WPC水解液經過處理得到的蛋白胨產品的理化指標、氨基酸組成及質量分數如表3和表4所示。

表3 蛋白胨的理化指標

通過表3和表4中的測定結果可以看出，該蛋白胨產品的總氮質量分數大于12%，氨基氮質量分數大于3%，說明該產品在質量上滿足培養基協會規定的蛋白胨類產品的要求[15]。同時由于乳清蛋白在氨基酸組成方面要優于其他的蛋白胨類的生產原料，所以利用乳清蛋白制得的蛋白胨產品能夠很好的滿足微生物生長的營養需求。

3 結 論

（1）使用風味蛋白酶水解WPC的最佳工藝條件為E/S（18 000 U/100 mL），溫度55℃，pH值為6.0，水解時間4.0 h，底物濃度為8%。此時，風味蛋白酶水解WPC的水解度為46.4%。

（2）利用此工藝條件生產的蛋白胨產品在總氮和氨基氮質量分數上，滿足蛋白胨產品的規格要求，其氨基酸組成豐富，微生物生長所需的谷氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸等氨基酸質量分數較高，該蛋白胨產品質量較高。

（3）此工藝的確定可以為乳品企業中大宗原料乳清蛋白找到新的利用途徑，開發出更高價值的產品，同時利用此酶解工藝技術也可以為后續功能性多肽產品的開發打下良好的基礎。

[1]FRANCISCO M R，JUAN B P，JOSE M O J.Process for Obtaining Plant Peptones with a High Hydrolysis Degree and Applications Thereof：United States,US 6372452 B1[P].2002-4-16.

[2]JAMES W S.Peptide Product：United States,US 6787168 B1[P].2004-9-7.

[3]PEDRO S G.Continuous Direct Enzymatic Protein Solubilisation Process for Industrial Waste：United States,US 2002/0042500 A1[P].2002-4-11.

[4]VERONIQUE D，LUPPO E，JAN G K.Protein Hydrolysates：United States,US 2004/0067279 A1[P].2004-4-8.

[5]DARRELL V C,HARAPANAHALLLI S M.Recovery of Peptones：United States,US 2007/0141230 A1[P].2007-6-21.

[6]馬歌麗，何紅，王俊偉.酪蛋白磷酸肽提取工藝[J].食品研究與開發，2009，30（9）：122-125.

[7]鄭鐵松，何國慶，曹立民.酪蛋白磷酸肽（CPPs）制備條件研究[J].浙江大學學報（農業與生命科學版），2000，26（1）：93-96.

[8]代永剛，楊貞耐，王海巖，等.乳蛋白源免疫活性肽研究進展[J].食品研究與開發，2009，30（11）：152-155.

[9]沈浥，盧蓉蓉，陳衛，等.乳清蛋白抗氧化肽的制備及酶解產物特性[J].食品與發酵工業，2009，35（7）：68-73.

[10]馮杰龍，林煒鐵，徐曉飛，等.生物活性肽及其蛋白酶水解法制備探索[J].廣州食品工業科技，18（3）：36-38.

[11]趙德英，張景宏.復合酶制劑中蛋白酶活力測定[J].中國飼料，1993，（10）：26-27.

[12]魏宜琴，趙學蘭.胃蛋白酶活力測定法的探討[J].生化藥物雜質，1991，（2）：74-76.

[13]趙新淮，馮志彪.蛋白質水解物水解度的測定[J].食品科學，1994，15（11）：65-67.

[14]張俊英，王彩云，靳燁，等.酶水解乳清蛋白工藝條件的研究[J].農產品加工，2009，（6）：35-37.

[15]陳天壽.微生物培養基的制造與應用[M].北京：中國農業出版社，1995.

Study on the production conditions of peptone using the enzymolysis of whey protein powder by flavourzyme

SHI Dan1，WANG Cai-yun1，YUN Zhan-you1，GAO Hai-yan2
（1.Inner Mongolia Yili Industrial Group Co.Ltd.，Hohhot 010080，China；2.Inner Mongolia Agricultural University，Institute of Food Science and Engineering，Hohhot 010018，China）

The production conditions of peptone using the enzymolysis of Whey Protein Powder（WPC）by Flavourzyme for increasing the added value of the ingredient WPC.The results showed that the best enzymolysis conditions were as follows：temperature 55℃,pH6.0,E/S 18 000 U/g,hydrolysis time 4.0 h,substrate concentration 8%，the degree of hydrolysis（DH）46.4%.With this technology,the peptone products in the physical and chemical results,amino acid composition and content were better than on similar products commercially available.

whey protein；degree of hydrolysis；flavourzyme；peptone

Q516

A

1001-2230（2011）10-0004-04

2011-04-06

石丹（1983-），男，工程師，碩士，研究方向為乳制品加工工藝。

云戰友