嗜酸乳桿菌的表面疏水性分析

趙維俊，呂嘉櫪，馬強，李瑛

（陜西科技大學 生命科學與工程學院，西安 710021）

嗜酸乳桿菌的表面疏水性分析

趙維俊，呂嘉櫪，馬強，李瑛

（陜西科技大學 生命科學與工程學院，西安 710021）

對嗜酸乳桿菌的表面疏水性進行分析。利用微生物粘著碳氫化合物法測定嗜酸乳桿菌的表面疏水率，通過采用不同環境條件和胰蛋白酶處理菌體細胞表面，初步確定嗜酸乳桿菌表面疏水性的影響因素。結果表明，影響菌體表面疏水性的因素有時間、溫度、pH值、濃度、Ca2+和胰蛋白酶，菌體表面疏水性具有時間、溫度、pH值和濃度依賴性，Ca2+和胰蛋白酶對其有一定作用，且表面疏水性與黏附能力之間存在著相關性；此外，推測能夠介導嗜酸乳桿菌表面疏水性的某些物質可能是一類蛋白質。

嗜酸乳桿菌；疏水性；黏附；影響因素

0 引 言

嗜酸乳桿菌具有促進腸道內微生物菌群的生態平衡，改善腸道菌群結構、促進腸道中有益菌的增殖、抑制有害菌的生長、增強機體免疫力和緩解乳糖不耐癥等重要生理功效，對于高血壓、高血脂、心臟病、糖尿病和癌癥的防治有著重要意義[1-3]。嗜酸乳桿菌通過黏附于腸上皮細胞表面，定植形成穩定的菌群發揮作用。因此，黏附是嗜酸乳桿菌發揮生物屏障功能的基礎。經國內外研究表明，細菌表面疏水性的強弱與細菌表面蛋白、菌毛、脂磷壁酸和莢膜等附著器有關，并且主要取決于其表面的某些物理化學特性[4]，被認為與細菌的特異性黏附相關。但是，現如今關于疏水性與黏附性關系的研究較少。

本研究以嗜酸乳桿菌為研究對象，通過體外測定其表面疏水率來分析表面疏水性的影響因素及其與黏附性的關系；通過研究不同處理條件對受試菌株疏水率的影響，初步確定嗜酸乳桿菌菌體表面疏水性表達所依賴的環境條件和物質條件，以及其表面疏水性與黏附性的相關性。

1 試 驗

1.1 材料

供試菌株為嗜酸乳桿菌 （Lactobacillus acidophilus）AS1.1854。

培養基和化學試劑：MRS肉湯培養基（均為質量濃度）：酪胨10.0 g/L，牛肉粉8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫-80 1.0 g/L，pH值為6.2±0.2；胰蛋白酶（Trypsin 1：250）；十六烷（Hexadecane）；其他試劑均為國產分析純。

儀器與設備：紫外分光光度計UV-2600型；高速冷凍離心機（HC-3018型）；數碼顯微鏡；隔水式恒溫培養箱GNP-9160型。

1.2 細菌的培養和保存

嗜酸乳桿菌以體積分數為1%接種量接種于MRS肉湯培養基，37℃厭氧培養10 h。菌種均在體積分數為30%甘油中于-80℃下凍存。

1.3 菌株表面疏水率的測定

通過試驗菌株對碳氫化合物的親和力反映菌株表面疏水性，采用微生物粘著碳氫化合物法（Bacteria Adhesion To Hydrocarbons,BATH）[2]，并略加修改，測定嗜酸乳桿菌細胞表面疏水性。將細菌培養物以6 000 r/min，4℃，離心10 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（濃度為0.2 mol/L的Na2HPO4·12H2O 18.5 mL+0.2 mol/L的NaH2PO4·2H2O 81.5 mL， 稀釋1倍，pH=6.2）洗滌菌體2次，10 mL/次[5]。將菌體以磷酸鹽緩沖液為空白對照，用磷酸鹽緩沖液調整菌液濃度，使其在分光光度計600 nm波長下OD值為0.6±0.02。取4 mL調整濃度后的菌液分別加入200 μL十六烷和二甲苯，對照組不加，該兩相體系通過渦旋徹底混合60 s，靜置15 min分層。取水相，以磷酸鹽緩沖液為空白對照，測量A600值，記錄。每組平行做10管，分別記錄OD值。進行5次獨立的實驗。

1.4 觀察指標和方法

（1）生長階段對嗜酸乳桿菌表面疏水率的影響。按體積分數為1%的比例接種嗜酸乳桿菌菌液于MRS肉 湯 培 養 基 ，37℃ 厭 氧 培 養4，6，8，10，12，14，16，18，24 h后，離心收集細菌，用磷酸鹽緩沖液洗滌后重新懸浮，在紫外可見分光光度儀上測定600 nm處的吸光度值，以培養時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制生長曲線。 分別取經4，6，8，10，12，14，16，18，24 h培養的嗜酸乳桿菌培養物，進行疏水率試驗。并在上圖基礎上以疏水率為次縱坐標作圖。

（2）不同培養溫度對嗜酸乳桿菌表面疏水率的影響。 分別將嗜酸乳桿菌置于28，32，37，41，45℃條件下培養10 h后，進行疏水率試驗。

（3）不同試驗溫度對嗜酸乳桿菌表面疏水率的影響。 試驗分別置于20，28，37，41，45，50，55℃條件下進行。

（4）pH值對嗜酸乳桿菌表面疏水率的影響。用濃度為1 mol/L鹽酸調節磷酸鹽緩沖液的pH值為7.0，6.0，5.5，5.0，4.5，4.0，3.0；分別懸浮菌體，進行疏水率試驗。

（5）菌懸液濃度對嗜酸乳桿菌表面疏水率的影響。取嗜酸乳桿菌培養物，用磷酸鹽緩沖液調整菌濃度（OD）分別 為0.2，0.3，0.5，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4；采用BATH法測定疏水率的濃度依賴曲線，以所加嗜酸乳桿菌的濃度為橫坐標，疏水率為縱坐標作圖。

（6）不同Ca2+濃度對嗜酸乳桿菌表面疏水率的影響[6]。 用0～8 mmol/L不同濃度的CaCl2水溶液，37℃處理菌體，30min，磷酸鹽緩沖液洗滌后，進行疏水率試驗。

（7）胰蛋白酶對嗜酸乳桿菌表面疏水率的影響：用0.0025～2.5 mg/mL不同濃度的胰蛋白酶，37℃處理菌體，30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌后，進行疏水率試驗。

1.5 菌株表面疏水率的計算及統計學處理

用單因素方差分析比較各組總體均數間差別，用t檢驗方法進行組間樣本均數的兩兩比較，用平均值±標準偏差確定疏水率參考值范圍。菌株表面疏水率為

疏水率 （%）=（對照組A600-實驗組A600）/對照組A600×100。

2 結果和分析

2.1 生長階段對疏水率的影響

通過對嗜酸乳桿菌在培養24 h內的發酵液OD和pH值及菌體表面疏水率的測定，結果如圖1所示。由圖1可以看出，在0～4 h培養時間內發酵液OD值和pH值變化較小，4～8 h發酵液OD呈穩步增長趨勢，平均高達1.60，發酵液pH值持續下降至4.42，8～14 h內變化趨勢明顯變小，而在14 h后發酵液OD和pH值基本分別保持在2.00和4.10左右。另外，菌體表面疏水率在培養8 h后出現最高值，以后隨著培養時間的增加菌體表面疏水率顯著降低。

2.2 不同溫度對表面疏水率的影響

在不同培養溫度條件下，嗜酸乳桿菌經10 h培養后，發酵液OD和pH值的變化如圖2所示。由圖2可以看出，發酵液OD和pH值在37～41℃培養條件下分別達到最大值1.92和最小值4.14，并且分別以十六烷和二甲苯作為吸附劑，菌體表面疏水率也具有顯著差異性，其中培養溫度為37～41℃時菌體表面疏水率最高。

在不同試驗溫度條件下，嗜酸乳桿菌表面疏水率也會隨試驗溫度的變化而變化（如圖3所示），彼此存在顯著性差異（P＜0.01）。當試驗溫度為41～45℃時，菌體呈現最高疏水率。

2.3 pH值對表面疏水率的影響

圖4為pH值對嗜酸乳桿菌表面疏水率的影響。由圖4可以看出，嗜酸乳桿菌表面疏水率受pH值的影響較大，當緩沖液pH值為4.0～4.5時，菌體表面疏水率均高于其他試驗組。當緩沖液pH值為7.0時，菌體表面疏水率顯著低于酸性緩沖液試驗組（P＜0.01）。

2.4 菌懸液濃度對表面疏水率的影響

在不同菌懸液濃度下嗜酸乳桿菌的表面疏水性如圖5所示。由圖5可以看出，嗜酸乳桿菌在濃度（OD）為0.2時，表面疏水率最高；但是菌懸液濃度變化量以濃度（OD）為0.5～0.6時最大，且此時表面疏水率與低濃度時相比沒有顯著性變化。而當濃度逐漸增大時，菌體表面疏水率也隨之發生極顯著的降低，濃度（OD）增至1.4時的表面疏水率降到最低值（P＜0.01）。

2.5 Ca2+和胰蛋白酶對表面疏水率的影響

嗜酸乳桿菌經不同濃度的Ca2+處理后，表面疏水性受到一定影響，結果如圖6所示。由圖6可以看出，隨著Ca2+濃度的增加，其表面疏水率也發生顯著的增高（P＜0.01）。當Ca2+濃度達到5 mmol/L時，表面疏水率最高。若再提高Ca2+濃度，則其表面疏水率不發生顯著變化。

胰蛋白酶對嗜酸乳桿菌表面疏水性的影響如圖7所示。由圖7可以看出，與未經處理的菌體細胞相比，經胰蛋白酶作用后的菌體細胞，表面疏水率發生極顯著的降低（P＜0.01）。當胰蛋白酶質量濃度達1.5 mg/L時，菌體的表面疏水性完全消失。

3 討 論

經國內外研究表明，細菌表面疏水性的強弱與細菌表面蛋白、菌毛、脂磷壁酸、莢膜等附著器有關，被認為與細菌的特異性黏附相關。因此，嗜酸乳桿菌的表面疏水性可能與其黏附性存在一定相關性。為了更好的研究嗜酸乳桿菌表面疏水性與黏附性的關系，我們利用BATH法研究了影響其表面疏水性的因素[7]。

從嗜酸乳桿菌的生長曲線（圖1）可以看出，嗜酸乳桿菌在0～4 h培養時間內為菌體調整期，4～8 h為菌體對數生長期，8～18 h菌體穩定生長，代謝產物量增大，18 h后菌體代謝減弱，開始大量衰亡。選取不同生長時間點的嗜酸乳桿菌進行疏水性試驗，結果隨著細菌生長時間的延長，疏水率逐漸增加，但菌體進入穩定期時，表面疏水率與其他階段差異具有顯著性；菌體進入衰亡期后，表面疏水率發生顯著降低。即嗜酸乳桿菌的表面疏水性具有時間依賴性。這表明菌體生長過程中，代謝產物可能參與調節自身的疏水作用。在穩定生長期，代謝旺盛，相關產物量較大，故而提高其表面疏水率，當進入生長后期時，由于代謝減慢，表面疏水率可能因缺少某些代謝物的調節而逐漸降低。

通過研究嗜酸乳桿菌培養溫度、試驗溫度、pH值及菌液濃度對表面疏水性的影響時，發現嗜酸乳桿菌的表面疏水性具有溫度、pH值及菌體濃度依賴性。菌體在37～41℃培養條件及41～45℃試驗條件下有利于疏水性的表達；當菌體處于酸性（pH值為4.0～4.5）環境中，有較強的表面疏水性；當菌體濃度（OD）為0.2時，菌體表面疏水率較高，菌體濃度（OD）為0.5～0.6時次之，但菌體吸附于等量有機相（十六烷和二甲苯）中的量相對于濃度（OD）為0.5～0.6時較低，這可能與有機相的吸附飽和度有關。此結果與雙歧桿菌黏附實驗的結果相似[8]。許多報道指出，乳酸菌的黏附還具有離子依賴性，本文研究了Ca2+對嗜酸乳桿菌表面疏水性的影響，發現Ca2+濃度在一定范圍內可提高菌體的表面疏水性。

為了進一步分析嗜酸乳桿菌表面疏水性與黏附性的相關性，根據已報道的乳桿菌黏附素組成（大多數為蛋白類物質）[9，10]，我們選用胰蛋白酶對該菌體細胞進行處理，所獲得結果與乳桿菌LGG的黏附特性相似[11]，胰蛋白酶處理能顯著降低嗜酸乳桿菌的表面疏水性，當胰蛋白酶達一定質量濃度（1.5 mg/L）時，菌體表面疏水性基本喪失。這說明了蛋白類物質在該菌的表面疏水性和黏附性表達過程中均起了重要的作用。

4 結 論

通過對嗜酸乳桿菌表面疏水性的分析，并參考大量報道資料，確定其表面疏水性與黏附能力之間存在著相關性，影響菌體表面疏水性的時間、溫度、pH值、濃度、離子和酶等因素，同樣也影響菌體黏附能力，表面疏水性高的菌株一般具有較高的黏附能力；此外，通過觀察Ca2+離子及酶類處理后嗜酸乳桿菌表面疏水性的變化，推測出：Ca2+可能作為信號傳遞物質，促進菌體自身物質代謝，提高表面疏水性的表達，以及能夠介導嗜酸乳桿菌表面疏水性的物質可能是一類蛋白質。但是具體的作用機制尚不清楚，在今后的研究中，將對菌體細胞代謝及相關蛋白進行進一步分析，從而為揭示乳酸菌黏附機制提供更多的依據。

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Analysis of the surface hydrophobicity of Lactobacillus acidophilus

ZHAO Wei-jun,LV Jia-li,MA Qiang,LI Ying
（College of Life Science and Engineering,Shannxi University of Science&Technology,Xi’an,710021,China）

We analyzed the surface hydrophobicity of Lactobacillus acidophilus.We utilized the method of microbial adhesion the hydrocarbons to determine the surface hydrophobic rate of Lactobacillus acidophilus and used the different environmental conditions and trypsin to process the cell to determine the influencing factors of the surface hydrophobicity of Lactobacillus acidophilus preliminary.Through this research,we obtained that the influencing factors of the surface hydrophobicity of Lactobacillus acidophilus were time,temperature,pH,concentration,Ca2+and trypsin.Cell surface hydrophobicity had the dependent manner of time,temperature,pH and concentration,and was affected by the Ca2+and trypsin,and was connected with the adhesion ability.In addition,we speculated that some substances which could mediate the hydrophobicity of Lactobacillus acidophilus may be a class of proteins.

Lactobacillus acidophilus；hydrophobicity；adhesion；influencing factors

Q935

A

1001-2230（2011）10-0008-04

2011-06-28

陜西省“13115”項目（2009ZDKG-20）；陜西省教育廳項目（2010JK446）。

趙維俊（1986-），男，碩士研究生，研究方向為應用微生物學。

呂嘉櫪