乳清多肽的分離純化及體外抗氧化活性研究

包怡紅，李銳達(dá)

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

乳清多肽的分離純化及體外抗氧化活性研究

包怡紅，李銳達(dá)

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

采用乳酸菌發(fā)酵乳清制備乳清多肽，利用超濾和凝膠Sephadex G-25分離純化乳清多肽，并研究了超濾后乳清多肽對(duì)羥自由基、氧自由基和DPPH自由基的清除作用。結(jié)果表明，超濾后乳清多肽主要包含兩個(gè)級(jí)分，分子量分別為2 031 u和328 u，對(duì)羥自由基、氧自由基和DPPH自由基具有清除作用。

乳清多肽；分離純化；抗氧化

0 引 言

隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品安全的關(guān)注度日益升高，天然抗氧化劑越來(lái)越受到人們的青睞，近年來(lái)，關(guān)于蛋白水解物抗氧化性的研究已有許多報(bào)道，如大豆蛋白[1]、玉米蛋白[2]、豬血蛋白等[3]。

乳清是生產(chǎn)干酪或干酪素時(shí)的副產(chǎn)品，含有15%以上的蛋白質(zhì)[4]，是一種來(lái)源廣泛的蛋白資源。隨著具有各種生物活性短肽的不斷發(fā)現(xiàn)，對(duì)乳清多肽的研究和開(kāi)發(fā)日益受到人們的關(guān)注，目前已有關(guān)于乳清蛋白水解物抗氧化作用的研究報(bào)道[5-7]。本課題前期工作中采用乳酸菌水解乳清蛋白制備乳清多肽[8]，本實(shí)驗(yàn)采用超濾、凝膠層析對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，并研究其體外抗氧化活性，進(jìn)一步了解乳清多肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，從而為乳清生物活性肽作為新型抗氧化劑的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫鹽乳清粉；保加利亞桿菌L34.5；嗜熱鏈球菌SP1.1；還原型谷胱甘肽；氧化型谷胱甘肽；VB12；Sephadex G-25；Tris；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)控自動(dòng)部分收集器；HL-2B蠕動(dòng)泵；TP10-20超濾設(shè)備；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)；722S可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白多肽的制備[8]

乳清粉按10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）復(fù)原后，采用保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌（菌種比1∶1）復(fù)合發(fā)酵，發(fā)酵條件：初始pH值為6.4，發(fā)酵溫度37℃，接種量5%，發(fā)酵時(shí)間14 h。發(fā)酵完畢后，沸水浴3 min滅酶，冷卻，4 000 r/min離心10 min取上清液，待用。

1.3.2 超濾分離純化

在一定的操作壓力、操作溫度下，選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為6 ku的聚砜類中空纖維膜進(jìn)行超濾，收集濾過(guò)液，經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥得超濾預(yù)分離的乳清多肽，用作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3 SephadexG-25柱層析分離純化[9]

（1）凝膠色譜測(cè)定條件。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)λ=285 nm；洗脫液：蒸餾水；流速：0.6 mL/min；溫度為室溫23℃；樣品質(zhì)量濃度為40 g/L；加樣量為1 mL。

（2）分析方法。取鉻酸鉀、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、VB12各10 mg，分別溶于1 mL洗脫液中，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將已處理好的交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25（1 cm×45 cm）裝柱，在前述凝膠色譜測(cè)定條件下操作，用記錄儀記錄流出液吸收情況。洗脫液洗脫至基線平穩(wěn)，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液或3%的樣品溶液1 mL，用量筒記錄最大吸收峰出現(xiàn)時(shí)洗脫液的流出體積（mL），以流出體積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)分子量的對(duì)數(shù)（lgM）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 羥自由基清除率的測(cè)定[10]

在試管中分別加入0.5 mL濃度為10 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL樣液、0.5 mL濃度為10 mmol/L的FeSO4溶液、3.5 mL蒸餾水，最后加入5 mL濃度為100 mmol/L的H2O2啟動(dòng)Fenton反應(yīng)，搖勻后于510 nm處測(cè)定吸光度Ai；取0.5 mL蒸餾水代替濃度為10 mmol/L的FeSO4溶液，測(cè)得的吸光度為Aj；取0.5 mL蒸餾水代替酶解液，測(cè)得的吸光度為A0。

1.3.5 氧自由基清除率的測(cè)定[11]

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。在試管中依次加入4.5 mL濃度為0.1 mol/L的Tris-HCl（pH值為8.2，內(nèi)含濃度為2 mmol/L的EDTA）緩沖溶液，4.2 mL雙蒸水，于25℃恒溫20 min后加入25℃預(yù)熱過(guò)的0.3 mL濃度為3 mmoL/L鄰苯三酚溶液（以濃度為10 mmol/L的HCl配制，對(duì)照管用濃度為10 mmol/L鹽酸代替），迅速搖勻，立即傾入比色皿中，在波長(zhǎng)325 nm處每30 s測(cè)定一次吸光值A(chǔ)，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘A的增值，此即為鄰苯三酚的自氧化速率A0。乳清抗氧化肽活性測(cè)定按上述操作，加入鄰苯三酚前，先加入一定量樣液，并減少同體積雙蒸水，其他操作均與上述相同，所測(cè)吸光度為Ai。

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾對(duì)乳清水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

乳清蛋白水解產(chǎn)物在操作壓力0.04 MPa（操作溫度25℃）下通過(guò)超濾膜。超濾前后乳清蛋白多肽的氧自由基清除率比較如圖1所示。

為了將乳清多肽混合物進(jìn)行有效分離，本研究選用了超濾作為初步的分離手段。有研究[12]發(fā)現(xiàn)低分子量的乳清蛋白酶解物（小于6 ku）具有較好的抗氧化活性，因此實(shí)驗(yàn)采用截留相對(duì)分子量為6 ku的纖維膜對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超濾處理。由圖1可以看出，透過(guò)液的氧自由基清除率與超濾前相比有了明顯提高，同時(shí)與濃縮液相比接近于兩倍，透過(guò)液的氧自由基清除率得到提高也可能與抗氧化肽通過(guò)超濾得到了濃縮有關(guān)。

2.2 SephadexG-25凝膠層析分析

2.2.1 肽分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

2.2.2 乳清多肽的凝膠層析分析

Sephadex G-25的上限截留分子量為5 000 D，超濾后的乳清水解液經(jīng)Sephadex G-25凝膠過(guò)濾色譜分離結(jié)果如圖3所示。

隨著洗脫的進(jìn)行分離得到的洗脫液紫外吸收度呈上升趨勢(shì)，當(dāng)達(dá)到一個(gè)最大值后又均呈下降趨勢(shì)，當(dāng)洗脫液體積達(dá)到60 mL左右時(shí)，多肽可被最大程度地洗出。組分Ⅱ峰高明顯大于組分Ⅰ，說(shuō)明組分Ⅱ在超濾混合物中所占比例較大。根據(jù)肽標(biāo)準(zhǔn)曲線直線方程y=-30.29x+118.19計(jì)算得組分Ⅰ和組分Ⅱ的相對(duì)分子量分別為2031 u和328 u，進(jìn)一步說(shuō)明水解物主要是一些小肽的混合物。

將分離后的組分Ⅰ和組分Ⅱ進(jìn)行抗氧化活性比較，從圖4可以看出，分離組分Ⅱ的氧自由基清除率大于組分Ⅰ，與透過(guò)液相比兩者的氧自由基清除率都有顯著提高，這可能與凝膠層析過(guò)程中產(chǎn)品中一些小分子糖類、游離氨基酸、無(wú)機(jī)鹽等成分被逐漸分離，肽得到進(jìn)一步濃縮有關(guān)。

2.3 超濾產(chǎn)物乳清多肽的抗氧化活性

2.3.1 清除羥自由基作用

由圖5可知，乳清多肽對(duì)羥自由基具有清除作用，其對(duì)羥自由基的清除率隨著濃度的增加而明顯增強(qiáng)，說(shuō)明乳清多肽具有抗氧化作用，但清除效果低于同濃度條件下的VC，其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為6.31 g/L。

2.3.2 清除氧自由基作用

由圖6可以看出，乳清多肽的氧自由基清除能力呈現(xiàn)量效關(guān)系，隨著濃度的增加逐步增強(qiáng)，但均小于同濃度條件下的VC溶液，其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為6.59 g/L。結(jié)果表明乳清多肽具有抗氧化性，能夠抑制氧自由基引起的氧化損傷。

2.3.3 清除DPPH自由基作用

實(shí)驗(yàn)比較了不同濃度的乳清多肽和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力，由圖7可以看出乳清多肽具有一定的DPPH自由基清除能力，且隨其濃度的增大而增大，但清除效果明顯低于VC，其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為6.07 g/L。

3 結(jié) 論

采用超濾法與凝膠過(guò)濾色譜相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)乳清蛋白發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了分離并獲得兩個(gè)級(jí)分，超濾后的乳清多肽具有一定的自由基清除能力，顯示了抗氧化活性。乳清多肽的抗氧化活性不如它的陽(yáng)性對(duì)照物，但由于乳清多肽是一種天然抗氧化劑，成本低廉，因此對(duì)它的研究開(kāi)發(fā)具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用潛力。

[1]吳永沛，劉明，倪輝.大豆抗氧化活性肽固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2007，7（6）：52-57.

[2]劉愛(ài)文，陳忻，王同文.酶法從玉米蛋白粉中提取短肽的初步研究[J].食品科學(xué)，2007，7（6）：409-411.

[3]孫騫，羅永康.豬血紅蛋白抗氧化活性肽的分離及脫色技術(shù)研究[J].肉類研究，2009（2）：18-20.

[4]蔡永敏，曹志軍，李發(fā)虎.乳清在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].今日科苑，2007（6）：43.

[5]VIRTANEN T,PIHLANTO A,AKKANEN S,et al.Development of Antioxidant Activity in Milk Whey during Fermentation with Lactic acid Bacteria[J].Journal of Applied Microbiology,2007,102：106-115.

[6]BLANCA H L,BEATRIZ M,LOURDES A,et al.Identification of Antioxidant and ACE-Inhibitory Peptides in Fermented Milk[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2005,85：1041-1048.

[7]彭新顏，孔保華，熊幼翎.乳清蛋白水解物抗氧化活性的研究[J].食品科學(xué)，2009，30（3）：167-172.

[8]包怡紅，李銳達(dá)，王戈，等.微生物發(fā)酵法制備乳清抗氧化肽的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2009，37（10）：11-14.

[9]田波，遲玉杰.蛋清蛋白水解物的水解程度與分子量關(guān)系的研究[J].食品工業(yè)科技，2002，23（11）：14-15.

[10]李艷伏，徐懷德，陳金海，等.木瓜蛋白酶酶解核桃粕蛋白產(chǎn)物抗氧化活性研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2008，8（5）：8-13.

[11]鄒國(guó)林，桂興芬，鐘曉凌，等.一種SOD的測(cè)活方法[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1986，4：71-73.

[12]劉志東，郭本恒，王蔭榆，等.乳源抗氧化肽的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2009，30（1）：282-283.

Study on purification and antioxidation of whey protein peptides

BAO Yi-hong,LI Rui-da
（College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040，China）

Whey protein peptides were prepared by the Latic Acid Baceria Fermentation and then purified with ultrafiltration and Sephadex G-25 column,the scavenging rate of OH·,O2·-and DPPH·of whey protein peptides purified with ultrafiltration were also studyed.The results showed that whey protein peptides purified with ultrafiltration contain two fractions mainly,their relative molecular weight were 2031 D、328 D respectively,it displayed a scavenging activity to the OH·,O2·-and DPPH·.

whey protein peptides;purification;antioxidation

Q516

A

1001-2230（2011）10-0012-03

2011-08-20

黑龍江省博士后科研啟動(dòng)資金項(xiàng)目（LBH-Q08142）。

包怡紅（1970-），女，教授，研究方向?yàn)楣δ苁称放c食品發(fā)酵。