酪蛋白類蛋白物的溶劑分級和酶水解對ACE抑制活性的影響

孫輝，趙新淮

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

酪蛋白類蛋白物的溶劑分級和酶水解對ACE抑制活性的影響

孫輝，趙新淮

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

利用響應面法優化類蛋白反應條件修飾酪蛋白水解物制備酪蛋白類蛋白物。酪蛋白類蛋白物的ACE抑制活性高于酪蛋白水解物，IC50值從52.6 mg/L降低到14.9 mg/L。利用乙醇-水混合溶劑對酪蛋白水解物和類蛋白物進行分級，結果表明，極性最低的溶劑得到的上清液部分活性較高，而沉淀部分活性較低。4種蛋白酶水解酪蛋白類蛋白物的分級產物，導致活性下降，除堿性蛋白酶外，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解產物ACE抑制活性為31.5%～46.8%，但是仍然高于酪蛋白水解物的ACE抑制活性（27.8%），表明類蛋白反應提高了酪蛋白水解物對一些蛋白酶的體外抵抗能力。

酪蛋白水解物；類蛋白反應；堿性蛋白酶；乙醇分級；ACE抑制活性

0 引 言

Oshima等[1]從蛋白凝膠水解物中分離出6個ACE抑制肽之后，大量的ACE抑制肽從不同食品蛋白質的酶解產物中分離，包括：大豆蛋白、玉米蛋白、菜籽蛋白、乳蛋白、魚肉蛋白、米糟和酒糟蛋白、雞蛋蛋白、蝦蛋白以及其他蛋白質[2-12]。

類蛋白反應在化學機制上涉及肽分子的縮合作用[13]、轉肽作用[14]。利用類蛋白反應修飾活性肽，將導致某些肽分子的結構改變（即產生新的序列）和活性變化。堿性蛋白酶催化下，酪蛋白水解物的類蛋白反應修飾可以提高其體外ACE抑制活性[15-16]。因此，本研究在此基礎上，利用乙醇-水溶劑體系處理修飾產物，得到2個分級產物（上清液部分和沉淀部分），然后研究分級產物的ACE抑制活性以及體外酶水解對活性的影響作用。

1 實 驗

1.1 材料

酪蛋白（蛋白質質量分數86.1%），堿性蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，兔肺丙酮粉和FAPGG（FA-Phe-Gly-Gly），其他所有試劑均為分析純。

1.2 設備

UV-2401PC型紫外可見分光光度計，AL204型分析天平，LGJ-1型真空冷凍干燥機，HZQ-F160型全溫振蕩培養箱，DELTA 320型精密pH計，G1-21M離心機，H-1型微型漩渦混合器，YH-4BS型遠紅外恒溫干燥箱，DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白水解物的制備

配制質量濃度為100 g/L的酪蛋白溶液，用濃度為2 mol/L的NaOH調節pH值至8.0，加入堿性蛋白酶（1 kU/g），55℃下分別水解1，2，3，4，5，6，7，8 h；取出20 mL樣品溶液，迅速置沸水浴中滅酶，冷卻后2 800 g離心20 min，分離出上清液，測定上清液中蛋白質和游離氨基量，計算其水解度；同時測定上清液的ACE抑制活性和IC50。根據ACE抑制活性大小確定酪蛋白水解物的制備條件，放大試驗，制備的上清液（酪蛋白水解物）真空冷凍干燥后于-20℃保藏。

1.3.2 酪蛋白水解物的類蛋白反應修飾

用堿性蛋白酶對酪蛋白水解產物進行類蛋白反應修飾。反應結束后，修飾產物（類蛋白物）在沸水浴滅酶15 min，冷卻后測定游離氨基量。

采用中心組合實驗，通過測定反應體系的游離氨基量減少量變化（底物游離氨基含量減去修飾產物游離氨基量），響應面法優化酶添加量、底物濃度、溫度等3個反應條件，然后分析類蛋白物的ACE抑制活性和IC50。

1.3.3 乙醇-水溶劑的分級處理

將具有最高ACE抑制活性的酪蛋白水解物和類蛋白物，分別加入到3個乙醇-水混合溶劑（體積比分別為3∶7，5∶5，7∶3）中，使其質量濃度達到500 g/L。 混勻后于9 000 g條件下離心30 min，分離出上清液和沉淀部分（分級產物），并分別測定肽收率、游離氨基量和ACE抑制活性。根據ACE抑制活性大小，確定溶劑的組成，放大試驗，將上清液和沉淀部分分別凍干。

1.3.4 分級產物的進一步酶水解

配置質量濃度為100 g/L的分級產物水溶液，分別加入蛋白酶進行水解，所選擇的條件為：堿性蛋白酶，pH值為8.0，溫度55℃，酶添加量1 000 U/g；胰蛋白酶，pH值為8.1，溫度37℃，酶添加量2 000 U/g；中性蛋白酶，pH值為7.0，溫度40℃，酶添加量1 000 U/g；木瓜蛋白酶，pH值為6.5，溫度45℃，酶添加量2 000 U/g。在反應進行10 min和30 min時，迅速加熱至95℃滅酶終止反應，得到的酶解產物進行相關分析。

1.3.5 有關分析和測定

1.3.5.1 蛋白質質量分數、水解度及蛋白酶活力的測定

（1）蛋白質質量分數測定采用凱氏定氮法[17]。

（2）游離氨基量及酪蛋白水解度（DH）測定采用鄰苯二甲醛（OPA）法[18-19]。

OPA試劑：稱取2.00 g十二烷基磺酸鈉（SDS），加入30 mL濃度為0.4 mol/L的硼酸緩沖溶液 （pH 9.5），水浴加熱使其完全溶解，冷卻至室溫后再加入1 mL質量濃度為80 g/L的OPA乙醇溶液和200 μL β-巰基乙醇，硼酸緩沖溶液定容至100 mL，此溶液要現用現配。

游離氨基量測定：配制不同濃度的亮氨酸標準溶液（0～30 mg/L），取3 mL標準溶液與同體積的OPA試劑混合并開始計時，5 min后在分光光度計上340 nm波長下測定。以吸光值為橫坐標、亮氨酸質量濃度為縱坐標繪制標準曲線。按照標準曲線制作步驟，測定樣品的吸光值，并根據標準曲線回歸方程計算其游離氨基量。

水解度計算公式[20]如下：

其中0.6 mmol/g為實際測定出的酪蛋白的游離氨基量。

（3）蛋白酶活力測定：采用福林酚法、以酪蛋白為底物測定[21]。

1.3.5.2 ACE抑制活性的測定

以FAPGG為底物，采用非連續分光光度法測定樣品的ACE抑制活性[22-23]。

ACE酶液：稱取50 mg兔肺丙酮粉浸泡于5 mL預冷至4℃的硼酸緩沖溶液（pH值為8.3，濃度100 mmol/L）中，放入4℃恒溫震蕩搖床中提取12 h，45 000 g冷凍離心20 min，上清液于4℃低溫保存。

FAPGG底物溶液：將FAPGG溶于濃度為100mmol/L的硼酸緩沖溶液 （pH值為8.3，濃度為300 mmol/L的NaCl），配制濃度為1.6 mmol/L的溶液。

ACE抑制活性測定：500 μL FAPGG底物溶液與100 μL超純水或ACE抑制肽溶液混勻，37℃預熱2 min，加300 μL ACE酶液并在37℃反應30 min，立即加100 μL EDTA（濃度為100 mmol/L）終止反應；加3 000 μL超純水稀釋，平行3次。0 min樣品的測定時先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。分光光度計上340 nm下分別測體系在0 min和30 min時的吸光值，計算差值△A（△A=A0min–A30min）。以單位時間內吸光值變化表示ACE酶活力，對ACE的抑制活性按下式計算：

式中：△Ac，加入超純水時吸光值在30 min內的變化；△Ai，為加入抑制劑時吸光值在30 min內的變化。

IC50計算：IC50定義為抑制50%ACE酶活力時抑制劑的濃度；配置不同濃度或質量濃度的ACE抑制劑，按以上步驟測定其ACE抑制活性。以抑制劑質量濃度的對數為橫坐標、ACE抑制活性為縱坐標，進行回歸分析，利用回歸方程計算抑制劑的半抑制濃度（IC50）。

2 結果與討論

2.1 酪蛋白水解物的制備

蛋白質本身的ACE抑制活性很低，甚至不具有活性，但通過體內或體外蛋白酶水解，釋放出來的肽即可在體內外發揮ACE抑制活性。堿性蛋白酶屬于內切酶， 對由Phe，Trp，Tyr，Glu，Met，Leu，Ala，Ser和Lys形成的肽鍵具有高度專一性[24]。選用堿性蛋白酶水解酪蛋白，可以獲得較高活性的ACE抑制肽。試驗結果表明，在所選擇的條件下利用堿性蛋白酶水解酪蛋白時，酪蛋白水解物的ACE抑制活性先隨水解時間增加而增加，后呈現降趨勢；在水解時間為6 h時，酪蛋白水解物的ACE抑制活性最高 （27.8%），此時水解度為10.9%， 其 游 離 氨 基 量 為1 780.9 μmol/g，IC50為52.6 mg/L。所以，選擇此酪蛋白水解物作為類蛋白修飾反應的底物。

2.2 酪蛋白水解物的類蛋白反應修飾與產物ACE抑制活性

固定反應時間為6 h，采用三因素五水平響應面方法（共20組實驗，表1）分析，以反應體系游離氨基減少量為響應值，研究酶添加量、底物質量分數、反應溫度對酪蛋白類蛋白反應修飾的影響。表1響應面分析的因素水平編碼

根據試驗結果（這里不再介紹），得到優化的修飾反應條件為：酶添加量3.1 kU/g，溫度25℃，底物質量分數50%，反應時間6 h。最大響應值游離氨基量減少為116.97 μmol/g。驗證試驗3次，得到的游離氨基量減少為112.09 μmol/g（平行值），與理論值無顯著差異，說明響應面法得到的條件參數可靠。酪蛋白水解產物修飾后，所得到的酪蛋白類蛋白物具有更高的ACE抑制活性（73.2%），分析結果表明其IC50降低至14.9 mg/L（低于酪蛋白水解物的52.6 mg/L）。所以，選擇此類蛋白物作為溶劑分級的底物。

2.3 乙醇-水溶劑分級處理與分級產物的ACE抑制活性

用3個乙醇-水混合溶劑 （乙醇和水體積比分別為3∶7，5∶5，7∶3）對酪蛋白水解物進行分級，得到相應的上清液部分和沉淀部分。分析結果表明這兩部分組成、ACE抑制活性存在不同，與所使用的分級溶劑的組成有關，如表2所示。上清液部分的回收率隨分級溶劑中乙醇體積分數的增加而減少，而沉淀部分則相反；由于有少量損失，二者之和不足100%。重要的是，上清液部分的ACE抑制活性均高于酪蛋白水解物，而沉淀部分活性均低于酪蛋白水解物，且用7∶3（體積比）乙醇-水溶劑分級處理時所得到的上清液部分活性最高（34.0%）。這表明：低極性的乙醇-水溶劑體系可以用于分離出更高ACE抑制活性的蛋白質水解物。

同樣，用這3個乙醇-水溶劑對酪蛋白類蛋白物進行分級處理，結果如表3所示。分析結果顯示，上清液、沉淀部分的回收率、游離氨基量、ACE抑制活性變化，與酪蛋白水解物的分級產物的變化規律基本一致。用7∶3（體積比）乙醇-水溶劑分級時，得到的上清液部分活性最高（78.8%），IC50降低至11.8 mg/L。

表2 酪蛋白水解物的乙醇-水溶劑分級與分級產物的ACE抑制活性

表3 酪蛋白類蛋白物的乙醇-水溶劑分級與分級產物的ACE抑制活性

Pan等研究指出，ACE抑制肽富含疏水性氨基酸和芳香族氨基酸[25]。乙醇極性低，水的極性較高。所選擇的3個溶劑中，7∶3（體積比）的乙醇-水溶劑具有最高的乙醇體積分數和最低的極性。所以，這個溶劑可以富集低極性（含較多的疏水性氨基酸）的肽組分，而沉淀則富集高極性（含較多親水性氨基酸）的肽組分。這樣就導致上清液部分具有較高的ACE抑制活性，而沉淀部分的ACE抑制活性相應降低。

2.4 分級產物進一步酶解與ACE抑制活性變化

對酪蛋白類蛋白物的乙醇-水溶劑（7∶3，體積比）分級產物進一步酶水解，分別測定水解產物的的游離氨基增加量和ACE抑制活性，表4給出分析結果。可以看出：（1）堿性蛋白酶對分級產物有較強的水解作用（游離氨基增加量較大），胰蛋白酶則剛好相反；（2）所有的水解產物的ACE抑制活性從19.2%到46.8%，均低于酪蛋白類蛋白物（73.2%）和分級產物（上清液部分78.8%，沉淀部分65.6%），表明分級產物的進一步水解會破壞類蛋白物的ACE抑制活性，且降低程度與水解酶（例如堿性蛋白酶）和水解時間（例如30 min）密切相關；（3）整體上看，堿性蛋白酶對分級產物的ACE抑制活性破壞最大，其他3種蛋白酶的破壞作用相對較小；（4）即使水解30 min，其他3種蛋白酶水解產物的ACE抑制活性為31.5%到46.8%，高于酪蛋白水解物的活性（27.8%）。通過以上分析可以看出，類蛋白反應能夠提高酪蛋白水解物的ACE抑制活性，同時還使得它（或者說分級產物）對一些蛋白酶具有一定的抵抗能力，即提高了其穩定性。

表4 酶水解對酪蛋白類蛋白物分級產物ACE抑制活性的影響

3 結 論

（1）利用堿性蛋白酶對酪蛋白進行水解和分離，在水解時間為6 h時制備出水解度為10.9%的酪蛋白水解物，其ACE抑制活性最高27.8%，IC50質量濃度為52.6 mg/L，游離氨基量為1780.9 μmol/g。

（2）利用堿性蛋白酶對酪蛋白水解物進行修飾時，以游離氨基含量減少量為指標，響應面法優化得到的反應條件為：酶添加量3.1 kU/g，底物質量分數50%，反應溫度25℃，反應時間6 h。制備的酪蛋白類蛋白物游離氨基量為1668.8 μmol/g，IC50降低至14.9 mg/L。

（3）對酪蛋白水解物進行乙醇-水溶劑分級處理。結果表明，7∶3（體積比）乙醇-水分級得到的上清液部分ACE抑制活性明顯高于酪蛋白水解物，沉淀部分的ACE抑制活性則低于酪蛋白水解物。對酪蛋白類蛋白物同樣進行乙醇-水溶劑分級處理，產生相似的結果。低極性溶劑富集疏水性肽組分，是分級產物上清液部分ACE抑制活性顯著提高的主要原因。

（4）酪蛋白類蛋白物分級產物的進一步酶水解，會降低其ACE抑制活性。分級產物對堿性蛋白酶的抗拒能力較弱，對胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的抗拒能力相對較強。水解后的分級產物其ACE抑制活性大多高于酪蛋白水解物，表明類蛋白反應提高了酪蛋白ACE抑制肽的活性與穩定性。

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Impact of solvent fractionation and enzymatic hydrolysis of casein hydrolysate modified by plastein reaction on its ACE inhibition

SUN Hui,ZHAO Xin-huai
（Northeast Agricultural University Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Harbin 150030,China）

The prepared hydrolysate was modified by the plastein reaction under the response-surface-methodology optimized conditions to prepare casein plasteins.The casein plasteins exhibited a higher ACE-inhibitory activity in vitro than the original hydrolysate as its value of IC50 was decreased from original 52.6 to 14.9 μg/mL.When the original hydrolysate or the plasteins was fractionated by ethanol-water solvents respectively,the soluble fractions obtained by the solvent of the lowest polarity had a higher activity but the precipitate fractions a lower one.Further enzymatic hydrolysis of the fractionated products of the plasteins by four proteases would damage their activities.The analysis results showed that the final hydrolyzed products of the plasteins by papain,pepsin or trypsin except for alcalase had a residue activity about 31.5%～46.8%,higher than the original hydrolysate（27.8%）.It was revealed that the carried out plastein reaction enhanced the resistance of casein hydrolysate to some proteases in vitro.

casein hydrolysate;plastein reaction;alcalase;ethanol fractionation;ACE-inhibitory activity

Q591.2

A

1001-2230（2011）12-0004-04

2011-09-26

黑龍江省高等學校科技創新團隊建設計劃項目（2010td11）。

孫輝（1986-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

趙新淮