熒光定量PCR法檢測益生菌飲料中Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9

其木格蘇都，王記成，張家超，張和平

（1.青島君益食品有限公司，山東 青島 266107 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

熒光定量PCR法檢測益生菌飲料中Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9

其木格蘇都1，王記成2，張家超2，張和平2

（1.青島君益食品有限公司，山東 青島 266107 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

益生菌活菌數(shù)是益生菌產(chǎn)品最重要的指標，而檢測益生菌方法的準確性和科學性則至關重要。本文采用熒光定量PCR法同時定量檢測益生菌飲料中Lactobacillus casei Zhang（L.casei Zhang）和Bifidobacterium lactis V9（B.lactis V9）的活菌數(shù)，并與平板菌落計數(shù)法進行比較。結果表明，熒光定量PCR法測得L.casei Zhang活菌數(shù)與平板菌落計數(shù)法測得活菌數(shù)差異不顯著；而采用熒光定量PCR法測得B.lactis V9活菌數(shù)顯著高于平板菌落計數(shù)法。熒光定量PCR法靈敏、特異、簡便快速，可定量檢測并真實反應L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)。

熒光定量PCR；菌落計數(shù)

0 引 言

益生菌在產(chǎn)品中的存活與否及其存活的數(shù)量是其發(fā)揮生理功效的前提。準確科學的檢測其活菌數(shù)至關重要。熒光定量PCR方法檢測多菌復合發(fā)酵樣品中特定菌株，檢測效率高，特異性和敏感性強，已經(jīng)被應用于乳酸菌的定量研究中[1]。

Lactobacillus caseiZhang（L.caseiZhang）分離自傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶（koumiss）[2]。大鼠和小鼠模型試驗、人體試驗以及基因組學和蛋白組學試驗研究顯示，L.casei Zhang具有良好的益生特性[3-9]。Bifidobacterium lactis V9（B.lactis V9）分離自健康蒙古族兒童糞便中[10]。臨床研究表明，其對便秘和急慢性腹瀉患者治療效果顯著[11]。

本文以L.casei Zhang和B.lactis V9雙聯(lián)益生菌共生發(fā)酵制得的豆乳飲料——百益多為樣本，采用熒光定量PCR法檢測二者的活菌數(shù)，并與平板菌落計數(shù)法比較，探尋更準確適合的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品：瓶裝“百益多”活性益生菌豆乳飲料。

藥品：TaKaRa-PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（大連寶生物RNA反轉錄純化試劑盒）和TransStart Green qPCR SuperMix（北京全式金熒光定量試劑），GB 4789.35—2010乳酸菌檢驗中所述試劑。

儀器：Eppendorf 5810高速冷凍離心機，ND-100微量紫外分光光度計，AB-Veriti PCR儀，ABStepOne熒光定量PCR儀，GB 4789.35—2010乳酸菌檢驗中所述儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

取連續(xù)生產(chǎn)3批產(chǎn)品，隨機抽取3瓶樣品進行試驗。

1.2.2 熒光定量PCR法

（1）RNA的提取及純化。將供試樣品搖勻后吸取1 mL液體移入離心管中離心收集菌體。之后按照Trizol試劑盒說明書提取樣品RNA，檢測RNA純度和濃度后，應用TaKaRa試劑盒于42℃水浴鍋中恒溫處理2 min去除基因組DNA，最后將純化的RNA貯存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

（2）RNA的反轉錄。以提取純化的總RNA為模板，使用TaKaRa反轉錄試劑盒，將混勻的反應液放置在PCR儀中37℃保溫15 min而后85℃加熱7 s最后將反轉錄成的cDNA降溫至4℃保藏。

（3）特異性引物的篩選。以L.casei Zhang全基因組序列為依據(jù)，選取其中一段特異性片段設計引物，應用該引物擴增Lactobacillus casei參考菌株，特異性引物信息見圖1。參照以往試驗及文獻[12]，設計雙歧桿菌屬的特異性引物，引物序列為Bifid-F CTCCTGGAAACGGGTGG；Bifid-RGGTGTTCTTCCCGATATCTACA。

（4）標準品的制備和標準曲線的繪制。標準品的制備：提取L.casei Zhang和B.lactis V9的宏基因組DNA，應用微量紫外分光光度計測定濃度，根據(jù)已知L.casei Zhang和B.lactis V9的基因組片段長度，依據(jù)拷貝數(shù)計算公式計算出單位濃度的基因組DNA中所包含的L.casei Zhang和B.lactis V9的個數(shù)，將此單位濃度的基因組DNA進行10倍系列稀釋并以此作為外標準品進行熒光定量PCR反應。標準曲線的繪制：以含有梯度稀釋個數(shù)的L.casei Zhang和B.lactis V9宏基因組DNA陽性模板的對數(shù)為橫坐標，以PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標擴增得到L.casei Zhang和B.lactis V9的定量擴增標準曲線，以此作為待測樣品中L.casei Zhang和B.lactis V9數(shù)量測定的參照標準。

（5）活菌數(shù)的測定。以待測樣品反轉錄的cDNA和標準品為模板，用L.casei Zhang和B.lactis V9特異性引物進行熒光定量PCR擴增。反應參數(shù)為：95℃（20 s）；40個循環(huán)，95℃（5 s），65℃（30 s），72℃（40 s）。 將擴增結果和標準曲線比對計算出每毫升樣品中L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)。

1.2.3 平板菌落計數(shù)方法

具體方法見GB 4789.35-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3個平行試驗數(shù)據(jù)采用SAS ANOVA程序處理，P＜0.05。

2 試驗結果

2.1 熒光定量PCR法測定

2.1.1 樣品中RNA提取

從“百益多”中提取的RNA經(jīng)電泳檢測后如圖2所示，從圖中可以看出總RNA 3條帶清楚分明，亮度較強，純度較高。完全滿足后續(xù)試驗需求。

2.1.2 L.casei Zhang和B.lactis V9熒光定量擴增標準曲線

以梯度稀釋的標準品為模板進行熒光定量PCR，繪制的L.casei Zhang和B.lactis V9熒光定量擴增標準曲線，曲線方程分別為：Y=-2.914x+40.211（R2=0.998） 和Y=-3.461x+47.627（R2=0.999）。該標準曲線R值分別為0.998和0.999，精確度較高，因此該標準曲線可以作為待測樣品中L.casei Zhang和B.lactis V9數(shù)量測定的參考依據(jù)。

2.1.3 L.casei Zhang和B.lactis V9活菌數(shù)檢測

以每毫升“百益多”中反轉錄的cDNA為模板，進行熒光定量PCR，將熒光定量的結果和L.casei Zhang及B.lactis V9擴增標準曲線進行比對后計算出每毫升“百益多”中所含有的L.casei Zhang和B.lactis V9活菌數(shù)，結果見表1。結果測得L.casei Zhang活菌數(shù)為（1.2±0.07）×109mL-1，B.lactis V9活菌數(shù)為（1.5±0.10）×109mL-1。

2.2 平板菌落計數(shù)法測定

采用平板菌落計數(shù)法測得2株益生菌活菌數(shù)見表1。3個平行樣品，選取適宜稀釋梯度，每個梯度涂布2個平板，結果取平均值，測得樣品中L.casei Zhang活菌數(shù)為（9.1±0.17）×108mL-1，B.lactis V9活菌數(shù)為（6.5±0.09）×108mL-1。

表1 百益多飲料中L.casei Zhang和B.lactis V9活菌數(shù)測定結果CFU·mL-1

3 討 論

本研究中采用熒光定量PCR法，對活性益生菌豆乳飲料“百益多”中2株益生菌L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)進行了檢測，同時以平板菌落計數(shù)方法進行了對比檢測。熒光定量PCR法測得L.casei Zhang活菌數(shù)為 （1.2±0.07）×109mL-1，B.lactis V9活菌數(shù)為（1.5±0.10）×109mL-1， 平板菌落計數(shù)法測得活菌數(shù)分別為（9.1±0.17）×108mL-1和（6.5±0.09）×108mL-1。 兩種方法檢測的L.casei Zhang活菌數(shù)差異不顯著 （P＜0.05），但是采用熒光定量PCR法測得的B.lactis V9活菌數(shù)顯著高于平板計數(shù)法（P＜0.05）。雙歧桿菌為專性厭氧菌，操作過程中，環(huán)境中的氧氣可能會導致部分雙歧桿菌死亡，進而影響活菌數(shù)的準確性[1]，另外，平板菌落計數(shù)是以選擇性培養(yǎng)基為基礎的，選擇性培養(yǎng)基成分較復雜，常以一定濃度抗生素來選擇計數(shù)目標菌[13-14]。本文采用熒光定量PCR法計數(shù)B.lactis V9，其活菌數(shù)是平板菌落計數(shù)法（MRS固體培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素莫匹羅星）的2.3倍。

益生菌活菌數(shù)的準確數(shù)量受其所在載體、其自身活力、應激狀態(tài)及所在產(chǎn)品生產(chǎn)條件等因素影響。應激狀態(tài)下的菌體細胞，在液體培養(yǎng)基中較固體培養(yǎng)基中生長良好[15]，這可能是本研究中平板計數(shù)法活菌數(shù)較低的原因之一。研究表明，雙歧桿菌在乳制品生產(chǎn)發(fā)酵過程中會聚集形成菌團，采用平板菌落計數(shù)法對此發(fā)酵產(chǎn)物中雙歧桿菌進行計數(shù)時，此菌團在固體培養(yǎng)基上形成單個菌落，而不是單個細胞形成的菌落，由此造成實際數(shù)量偏低[15]，這也可能是本研究中平板計數(shù)法活菌數(shù)較低的另一原因。另外，本研究所用抗生素選擇計數(shù)目標菌B.lactis V9，菌體活力及數(shù)量對抗生素濃度的敏感程度不同，可能對活菌數(shù)造成一定影響。

通過提取RNA再發(fā)轉錄為cDNA，然后用熒光定量PCR檢測樣品中活菌數(shù)，此方法已應用于發(fā)酵乳制品和益生菌制品中乳酸菌的定量檢測，大量研究結果表明此方法檢測乳酸桿菌，快速、靈敏而且特異性較高[16-17]。因此，采用熒光定量PCR法計數(shù)更能真實的反應“百益多”中L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)。

4 結 論

本文以平板菌落計數(shù)法為對照，通過熒光定量PCR法，檢測活性益生菌豆乳飲料“百益多”中2株益生菌L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)。結果表明熒光定量PCR法操作簡單，檢測時間短，檢測結果可靠性好，穩(wěn)定性高，可真實反應檢測樣品中L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌數(shù)。

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Lactobacillus casei Zhang Bifidobacterium lactis V9 Method of fluorescent quantitative PCR for detection of Lactobacillus casei Zhang and Bifidobacterium lactis V9

Qimugesudu1,WANG Ji-cheng2,ZHANG Jia-chao2,ZHANG He-ping2
（1.Qingdao Junyi Food Co.Ltd.,Qingdao 266107,China 2.Key Lab of Dairy Biotechnology and Bioengineer of Education Ministry of China,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China）

The viable count of probiotic is considered as the most important index and the accurate and scientific assay of probiotic viable number is essential to probiotic products.In the present study,the fluorescent quantitative PCR method and plate colony counting method were used and compared for detection of bacterial viable numbers of Lactobacillus casei Zhang and Bifidobacterium lactis V9 in probiotic fermented beverage.The result showed that there was no significant difference of L.casei Zhang number between two methods,whereas the numbers of B.lactis V9 detected by two methods were significant difference.It is suggested that fluorescent quantitative PCR method appear to be highly accurate,specific,fast and reliable for quantification of L.casei Zhang and B.lactis V9.

Fluorescent quantitative PCR;colony counting;Lactobacillus casei Zhang;Bifidobacterium lactis V9

TS252.7

A

1001-2230（2011）12-0031-03

2011-10-08

國家高技術研究發(fā)展計劃（863項目，2011AA100901，

2011AA100902）。

其木格蘇都（1983-）女,工程師,從事乳制品科學方面的研究。

張和平