產細菌素乳酸菌的篩選及其純化和穩定性研究

陳 沛，王雪青，阮海華

（天津商業大學a.天津市食品與生物技術重點實驗室，b.物技術與食品科學學院，天津 300134）

產細菌素乳酸菌的篩選及其純化和穩定性研究

陳 沛，王雪青，阮海華

（天津商業大學a.天津市食品與生物技術重點實驗室，b.物技術與食品科學學院，天津 300134）

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、單增李斯特菌、枯草芽孢桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌為指示菌，從30個健康嬰兒的糞便中篩選得到1株具有廣譜抑菌作用的菌株，經鑒定為乳酸乳球菌（編號F－6－B）.該菌株的培養條件為：MRS培養基起始pH 6.0，30℃靜置培養48h.將其發酵液經硫酸銨沉淀，Hitrap SPHP（GE）陽離子交換柱層析后，得到的樣品通過Tricine－SDS－PAGE為一條帶，相對分子質量為3 300～5 800之間.經不同酸、熱處理，該細菌素仍具有較好的抑菌活性，表現出較好的熱穩定性和廣譜的活性pH值范圍，對胰蛋白酶處理敏感性差.

細菌素；乳酸菌；抑菌作用

細菌素（Bacteriocin）是由某些細菌在代謝過程中產生的一類具有抑菌作用的蛋白質或多肽，常表現為對同種或近源菌種有特異性的抑制作用［1］，而具有廣譜抑菌作用的細菌素很少見.乳酸菌在利用乳糖或葡萄糖的代謝過程中，伴隨乳酸發酵，可產生很多物質，如有機酸、過氧化氫和細菌素等，具有抑制腐敗菌生長的特點，是健康人和動物腸道的優勢菌群之一，對于維持腸道微環境的穩定與健康發揮著重要的作用［2－3］.腸內乳酸菌種植種群與健康長壽有著非常密切的關系.乳酸細菌素抑菌譜與產生菌密切相關，現已發現的乳酸菌細菌素有40余種，但廣泛應用的只有乳酸鏈球菌素（Nisin），因此研發具有廣譜抗菌作用的新型乳酸菌細菌素具有十分重要的意義.

乳酸菌在自然界中分布很廣，在其生長過程中，除了產生乳酸之外，還產生一些其他的抗菌物質，可以抑制腸道腐敗菌的繁殖，起到延緩衰老、抗腫瘤、降血脂、降膽固醇、增強免疫力等保健功能，被世界上公認為安全的食品級微生物.人體腸道內擁有乳酸菌的數量，隨著人年齡的增長會逐漸減少，當人到老年或生病時，乳酸菌數量可能下降100至1 000倍，直到老年人臨終時完全消失.因此，嬰兒糞便中的乳酸菌，無論是數量還是種屬，都占據十分重要的優 勢 地 位.國 內 外 學 者 陸 續 從 泡 菜［5－6］、奶 制品［7－8］、肉制品［9－10］等食品中發現產細菌素的乳酸菌，但從糞便中篩選還很少見，本研究將從嬰兒糞便中發現新的細菌素.

利用乳酸菌鑒別培養基對來自30個健康嬰兒糞便樣品進行初篩，并通過抑菌圈實驗對初篩得到的60個乳酸菌復篩，對得到的陽性菌株的生長特性及其產細菌素進行了分離純化，并對其熱、酸、堿穩定性和酶的敏感性進行了系列研究，旨在研發新的細菌素.

1 實驗

1.1 材料

實驗菌種：大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、藤黃微球菌（Micrococcusluteus）、單增李斯特菌（Listera）、枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）、志賀氏菌（shigella）、沙門氏菌（salmonella），均來自天津商業大學微生物教研室.

培養基［4］：MRS培養基、LB培養基、CM502培養基，溴鉀酚紫MRS鑒定培養基.

1.2 實驗方法

1.2.1 產細菌素乳酸菌株的分離

將采集到的嬰兒糞便用生理鹽水進行10倍遞增稀釋，得到稀釋度分別為 10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6的樣品，并將其均勻地涂布于含有0.02g／mL CaCO3的 MRS平板上，于30℃培養48 h，挑取有溶鈣圈的單菌落于含有溴鉀酚紫的MRS培養基劃線分離，反復純化.挑取單菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察乳酸菌的形態及顏色是否一致.

1.2.2 抑菌試驗

采用抑菌圈實驗法［2］.具體操作如下：將過夜培養的指示菌培養液的光密度值 （OD600）調至0.1，作為指示菌工作液，取出100μL均勻涂布于LB平板上（李斯特菌涂于CM502平板上）.乳酸菌以體積分數為1%的接種量接種到5mL MRS液體培養基中，將各供試菌株連續培養3代，30℃ 培養48h，4℃ 離心15min，取上清液用0.22μm濾膜過濾.用1mol／L NaOH將過濾后的上清的pH值調至7.0.將牛津杯均勻放于涂好指示菌的平板表面，吸取100μL制備好的發酵液加入牛津杯中，37℃培養過夜，觀察抑菌圈直徑.選取有抑菌圈的發酵液進行復篩，用體積分數為85%的硫酸銨對發酵液上清進行硫酸銨沉淀，用pH 6.0的20mmol／L乙酸鈉將沉淀復溶后，進行抑菌試驗，有抑菌圈的即為目的菌株.

1.2.3 生物學特性的研究

1.2.3.1 細菌素的熱穩定性

將過濾除菌的發酵液上清分別用70℃，100℃處理30min，25℃，70℃，90℃，100℃處理1 h，121℃處理15min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，選用未經處理的發酵液為陽性對照，而MRS培養基為空白對照，進行抑菌實驗，以抑菌圈直徑的大小反映該細菌素的熱穩定性.

1.2.3.2 細菌素的酸堿穩定性

將過濾除菌的發酵液上清分成不同組，分別用1mol／L NaOH，1mol／L HCl調至不同的pH（pH 2.0，pH 3.0，pH 4.0，pH 5.0，pH 6.0，pH 7.0，pH8.0，pH 9.0，pH 10.0，pH 11.0，pH 12.0），于25℃處理2h，以金黃色葡萄球菌為指示菌，以未經處理的發酵液為陽性對照，MRS培養基為空白對照，以抑菌圈直徑的大小反映該細菌素的酸堿穩定性.

1.2.3.3 細菌素對胰蛋白酶的敏感性

用5mg／mL胰蛋白酶對發酵液處理2h，以金黃色葡萄球菌為指示菌，以未經處理的發酵液為陽性對照，MRS培養基為空白對照，以抑菌圈直徑的大小反映該細菌素對胰蛋白酶的敏感性.

1.2.4 細菌素的分離純化

將乳酸菌以體積分數為1%的接種量接種到1LMRS液體培養基中，30℃ 培養48h，4℃，以4 000r／min離心15min，上清液用0.22μm膜過濾除菌，對發酵上清液用體積分數為60%的硫酸銨沉淀.再以16 000r／min于4℃的條件下離心10min，棄上清，留沉淀.將沉淀溶于1LpH 6.0的20mmol／L乙酸鈉溶液中并經過用乙酸鈉平衡好的Hitrap SP HP（GE）陽離子交換柱分離，用pH 6.0的20mmol／L 乙酸鈉與含有 500mmol／L NaCl的pH 6.0，20mmol／L乙酸鈉進行梯度混合洗脫.收集樣品，進行抑菌試驗.

1.2.5 乳酸菌細菌素產生菌株的篩選

對采集到的樣品經10倍遞增稀釋，涂布于乳酸菌鑒別培養基，于30℃培養48h，挑取有溶鈣圈的單菌進行反復純化.將分離得到的乳酸菌接種于5 mL的液體MRS培養基，30℃培養過夜后，除去菌體，將發酵液上清調pH值至7.0，進行初篩抑菌實驗.將初篩有抑菌圈的菌株進行復篩.復篩用質量分數為85%的硫酸銨進行沉淀，沉淀后得到一株具有廣譜抑菌活性的菌株，編號為F－6－B.

2 結果與討論

2.1 F－6－B的胰蛋白酶敏感性

將F－6－B經胰蛋白酶處理，以未經 MRS培養基處理的樣品為對照，檢測抑菌活性結果見表1.從表1可看出，F－6－B所產生的細菌素有著與Nisin相似的抑菌活性，即對胰蛋白酶不敏感.

表1 胰蛋白酶水解處理對細菌素抑菌活性的影響Table 1 Effect of trypsin hydrolysis treatment on bacteriocins antibacterial activity

2.2 菌株的形態學特征鑒定

F－6－B經革蘭氏染色和鏡檢鑒定為革蘭氏陽性球菌，短鏈，無芽孢、鞭毛、莢膜.在 MRS平板上生長呈圓形、直徑約1.2mm、乳白色、低凸起、邊緣整齊、不透明的光滑型菌落，初步鑒定為乳酸乳球菌.

2.3 細菌素的生物學特性

2.3.1 溫度對細菌素活性的影響

按照1.2.3.1實驗方法所做結果見表2.從表2可以看出，該細菌素對熱有很好的穩定性，用121℃處理15min后仍然具有抑菌活性.

表2 熱處理對細菌素抑菌活性的影響Table 2 Effect of heat treatment on bacteriocins antibacterial activity

2.3.2 酸堿度對細菌素抑菌活性的影響

用1mol／L HCl，1mol／L NaOH 將F－6－B菌株發酵離心上清液分別調至不同的pH值，并在25℃下水浴2h后再調回對照pH7.0.以未經處理的發酵液對照，檢測抑菌活性，結果見圖1.從圖1可以看出，當發酵液的pH值為2.0～7.0時，細菌素的抑菌活性隨著酸性的減弱而增大；但當pH值＞7.0時，細菌素的抑菌活性開始緩慢下降，至pH值 ＞10.0后，抑菌活性急劇下降.因此該細菌素在堿性條件下不穩定，隨著堿性的增加，其抑菌活性會減少，而在中、酸性條件下則表現有較好的穩定性.

圖1 酸堿度對細菌素穩定性的影響Figure 1 Influence of pH.value on bacteriocins stability

2.3.3 細菌素在不同pH條件下的熱穩定性

將F－6－B菌株發酵離心上清液分別調至pH值為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，分別于25℃，70℃，90℃，100℃，121℃溫度下處理不同的時間，之后再回調至中性環境，以未經處理的原液作為對照，檢測抑菌活性，結果見表3.

表3 細菌素在不同pH條件下的熱穩定性Table 3 Inhibitory activities of bacteriocin at different temperatures

從表3可以看出，細菌素在酸性條件下有很好的熱穩定性，經121℃處理15min后仍然有抑菌活性.而當pH值大于7.0時熱穩定性隨著pH值的增大而逐漸減弱，當pH值為10.0時，僅在70℃下處理30min，便觀察不到抑菌圈.

2.4 細菌素的分離純化

將細菌素的發酵液上清經過質量分數為60%的硫酸銨沉淀，Hitrap SP HP（GE）陽離子交換柱層析收集到的樣品，經電泳鑒定為一條帶，該細菌素的相對分子質量為3.3×103～5.8×103.結果見圖2.

圖2 細菌素純化后電泳圖Figure 2 Tricine－SDS－PAGE of bacteriocins purified by Hitvap SPHP（GE）

3 結論

利用從30個健康嬰兒中分離得到的一株產廣譜細菌素的乳酸菌（F－6－B），通過排除發酵液上清中有機酸和過氧化氫的影響，初步證明F－6－B產生的是一種細菌素，該細菌素的抑菌活性與Nisin相似.

對該乳酸菌產生的細菌素進行了初步研究.將分離得到的乳酸乳球菌進行30℃，48h培養后，對其進行分離純化，相對分子質量在3 300～5 800.同時對細菌素進行耐酸堿，熱穩定以及蛋白酶敏感等實驗，發現該細菌素在酸堿環境下均具有很強的抑菌作用和很好的熱穩定性，即使在121℃加熱15min的條件下，仍有抑菌活性，并且表現對胰蛋白酶不敏感.與目前在食品加工中廣泛使用的Nisin相比，由于其較好的熱穩定性和酸堿穩定性，使其具有更好的加工特性，預示著該細菌素在食品生物防腐劑等方面，具有潛在應用價值.

［1］ Lucy H Deegan，Paul D Cotter，Colin Hill，et al.Bacteriocins：biological tools for bio－p reservation and shelf－lifeextension［J］.International Dairy Journal，2006，16：1058－1071.

［2］ 王成濤，孫寶國.產類細菌素乳酸菌的篩選及其生物學特性研究［J］.中國釀造，2008，23：50－53.

［3］ 石金舟，陳麗園.1株產細菌素乳酸菌的篩選和鑒定［J］.中國微生態學雜志，2005，17（6）：413－414.

［4］ 凌代文，陳秀珠.乳酸菌分類鑒定和實驗方法［M］.北京：中國輕工業出版社，1999：10－30.

［5］ 姚麗婭，徐為民，諸永志，等.產細菌素乳酸菌的篩選及鑒定［J］.食品工業科技，2008，29（1）：160－164.

［6］ 張艾青，劉書亮，詹莉，等.產廣譜細菌素乳酸菌的篩選 ［J］.中國釀造，2007，167（2）：45－48.

［7］ 曾獻春，莊偉偉.駱駝酸乳中乳酸菌的抑菌實驗研究［J］.中國釀造，2009，205（4）：84－86.

［8］ 鄧美艷.一株產細菌素乳酸菌的分離和鑒定［J］.食品科技，2010，35（3）：33－36.

［9］ 敖靈，馮敏，劉書亮，等.肉源產廣譜細菌素乳酸菌的篩選及其細菌素特性研究［J］.中國釀造，2008，186（9）：67－70.

［10］ 曾志剛，陳英，余柏松.細菌素產生菌的篩選及其細菌素的分離純化［J］.中國抗生素雜志，2003，28（5）：257－259.

Screening bacteriocin－producing lactic acid bacteria and purification of bacteriocin and its stability

CHENPei，WANGXueqing，RUANHaihua
（a.Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnogy，b.College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

One strain of bacteriocin－producing bacterium was isolated from feces of 30healthy infants，usingEscherichiacoli，salmonellasMicrococcusLuteusListera，bacillussubtilis，shigella，Staphylococcusaureusas indicate germs，and was identified asLactococcusschleifer（number F－6－B）.The bacteriocin was obtained from the fermentation broth of culture by ammonium sulfate precipitation and ion－exchange chromatography of Hitrap SPHP（GE）.The molecular weight of the bacteriocin was 3 300－5 800that determined by Tricine－SDS－PAGE.Treated with acid，heat and enzyme，the bacteriocin still had significant effects on bacteriostasis，exhibiting its better thermostability，a broad－spectrum pH range of activity and poor sensitivity to trypsin.

bacteriocin；lactic acid bacteria；antibacterial ability

Q936

A

1671－1114（2011）02－0082－04

2010－04－25

天津市科委應用基礎重點資助項目（08JCZDJC16600）；國家科技部資助項目（2008BAD94B09）

陳 沛（1986—），女，碩士研究生.

王雪青（1964—），女，博士，教授，主要從事生物活性物質方面的研究.

（責任編校 紀翠榮）