α-乳白蛋白油酸復合物對SGC-7901細胞增殖的影響

崔巍巍，許曉曦，王紅卓志國

（東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030）

α-乳白蛋白油酸復合物對SGC-7901細胞增殖的影響

崔巍巍，許曉曦，王紅卓志國

（東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030）

分別采用了MTT法檢測細胞增殖，Hoechst33258染色觀察細胞形態變化，以及電泳法觀察DNA梯形條帶研究經油酸誘導的牛乳α-乳白蛋白分別以不同濃度不同時間作用于胃癌SGC-7901細胞對其增殖作用的影響。結果表明，α-乳白蛋白油酸復合物對胃癌SGC-7901細胞的確有明顯的促凋亡作用。

乳白蛋白；油酸；胃癌；凋亡

0 引言

α-乳白蛋白是采用加熱酸凝法凝固乳清中的蛋白質所得，是一種不可溶的天然濃縮乳清蛋白。它必需氨基酸和支鏈氨基酸的極好來源；是惟一能結合鈣的乳清蛋白，其成分接近人乳，不易過敏，是調節睡眠、食欲情緒的重要因子。α-乳白蛋白富含半胱氨酸和蛋氨酸，能維持人體內抗氧化劑的水平，并，增加骨骼強度和降低LDL膽固醇水平。同時，α-乳白蛋白還能調理腸胃功能，加速營養均衡及吸收；加速傷口的愈合[1-3]。

近年研究表明乳鐵蛋白具有明顯的抗腫瘤作用[4]，α—乳白蛋白雖然不具抗癌活性[5]，但經油酸誘導后對白血病細胞有抑制作用[6]。

本研究旨在將蛋白與油酸復合后作用于胃癌細胞，采用MTT法、Hoechst33258染色法和瓊脂糖凝膠電泳法研究其對胃癌細胞的增殖抑制作用。

1 實驗

1.1 材料

RPM I-1640細胞培養基；DMSO（二甲基亞砜）；小牛血清；MTT；胰蛋白酶；Hoechst33258凋亡染色試劑盒；倒置熒光顯微鏡；人胃癌細胞株SGC–7901；其他所用試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

胃癌SGC-7901細胞用質量分數為10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素質量濃度為100 mg/L的RPM I-1640培養基培養，置于37℃質量分數為5%的CO2飽和濕度細胞培養箱培養。每24 h換液，質量分數為0.25%胰酶消化，每2～3 d傳代1次。取對數生長期細胞進行實驗[6-8]。

1.2.2 藥物α-乳白蛋白油酸復合物的制備

M.Svensson等[9]研究了乳白蛋白油酸復合物的制備過程。DEAE-Trisacryl M經緩沖液（bufferA: 10MmTris-HCl，pH=8.5；bufferB：buffer A包括濃度為1 mol/L的NaCl)處理后添加到（14cm×1.6cm）的離子交換色譜柱然后將柱子連接到GE離子交換色譜系統中。10 mg油酸溶于100 μL體積分數為99.5%的乙醇溶液中超聲3 min。然后加入10 mL濃度為10 mmol/L的Tris/HCl（pH=8.0），接著將處理后的油酸加入到柱子中進NaCl梯度洗脫對油酸進行分散。10 mg的α-乳白蛋白溶于20 mL濃度為10 mmol/L的Tris/HCl（pH= 8.0）包括濃度為0.08 mmol/L的EDTA上樣。洗脫液用3.5 ku的透析袋除鹽至少換4次水然后冷凍干燥。流速為1 mL/min，記錄儀0.1 cm/min。緩沖液使用前需脫氣及利用0.22 μm的濾膜進行過濾。洗脫峰在280 nm的波長下進行檢測[10]。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖

取對數生長期細胞用質量分數為0.25%的胰酶消化，含質量分數為10%胎牛血清的RPM I-1640培養基培養調整細胞濃度為5×104mL-1，以100 μL/孔接種96孔板，細胞貼壁生長過夜。設實驗組為A，B，C，D，E組；分別加入濃度為10，15，20，25、30 mmol/L乳鐵蛋白培養基，并以不含乳鐵蛋白的培養基為對照組E，200 μL/孔，每個濃度設3個復孔。設空白孔用于調零，對照組各孔加入等量的培養基。將96孔板置于37℃質量分數為5%的CO2飽和濕度下細胞培養箱培養12，24，48 h后，加入MTT（質量濃度為5 g/L）20 μL/孔繼續孵育4 h。棄上層清液，加入DMSO150 μL/孔，搖床震蕩10 min混勻，用酶標儀測定570 nm各孔吸光度值（A值)。按照公式計算細胞增殖抑制率（Inhibiting Rate，IR）：IR=MTT法抑制率=(對照組OD值一實驗組OD值)/對照組OD值×100%。每組實驗重復3次[11，12]。

1.2.4 Hoechst染色觀測細胞凋亡

取經體積分數為70%乙醇中浸泡的潔凈蓋玻片，無菌超凈臺內吹干，再用細胞培養液洗滌一遍。將蓋玻片置于6孔板內，種入細胞過夜，使約為50%～80%滿。設實驗組A，B，C，D，E組；分別加入濃度為10，15，20，25，30 mmol/L乳鐵蛋白培養基，并以不含乳鐵蛋白的培養基為對照組E，1 mL/孔，設空白孔用于調零，對照組加入等量的培養基。孵育48 h后，去培養基，加入0.5 mL固定液，固定（4℃過夜）。去固定液，用PBS洗兩遍，每次3 min，洗滌期間手動晃動。按照Hoechst 33258染色試劑盒說明書，每孔加Hoechst 33258染色液0.5 mL，避光染色5 min，期間手動晃動數次。去染色液，用PBS洗兩遍，每次3 min，吸盡液體。洗滌時手動晃動。滴一滴防熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡，于倒置熒光顯微鏡藍色熒光激發下觀察細胞形態學變化。熒光顯微鏡的紫外光可檢測到呈藍色的細胞核。激發波長350 nm左右，發射波長460 nm左右[13]。

1.2.5 DNA的提取瓊脂糖凝膠電泳

分別收集1×106細胞mL-1的實驗組和對照組細胞，200 r/min1離心洗滌后，細胞在Eppendorf離心管內懸浮于1 mL內含10 mmol的Tris·HCl（pH=8.0）、1 mmol的EDTA、10 mmol的NaCl、1%SDS的DNA抽提緩沖液中，再補充20 μg的RNAase100 μg蛋白酶K，用玻棒攪拌至黏稠狀，置37℃溫箱中12 h，待冷卻至室溫后，加入等容積飽和酚溶液，轉動離心管混勻兩相，以12 000 r/min離心，吸出上層黏稠水相，移至另一Eppendorf離心管內，再加等體積飽和酚溶液抽提一次，然后用1:1的氯仿酚溶液抽提后，將上層水相移入另一管內，加入濃度為0.3 mmol/L乙酸鈉-乙醇溶液DNA，加入二倍容積冰凍無水乙醇置冰格中30 min，取出在4℃、轉速為12 000 r/min離心10 min收取DNA，棄去無水乙醇后用70%乙醇混勻漂洗，開蓋室溫放置15 min揮發乙醇，加入含1 mmol的EDTA和10 mmol的Tris·HCl（pH=7.8）TE緩沖液，使DNA溶解，放置4℃冰箱保存備用[14]。

取5 μL提取的DNA樣品與質量分數為0.25%溴酚藍和質量分數為40%蔗糖溶液混勻后，加入到瓊脂糖凝膠樣品槽內，在TAE（由pH值為8.0濃度為1 mmol/L的EDTA和濃度為45 mmol/L的Tris-硼酸）緩沖液配制的內含質量濃度為0.5 mg/L溴乙錠染料的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓穩定在90 V，電泳0.5 h后，取出標本，在紫外燈下觀察具有細胞凋亡特征的DNA階梯狀條帶；而壞死細胞DNA電泳，則呈模糊的彌散條帶（smear）[15]。

2 結果與分析

2.1 MTT法檢測細胞增殖

SGC-7901細胞隨加藥濃度變化凋亡率曲線如圖1所示。由圖1可以看出，α-乳白蛋白油酸復合物濃度在10～30 mmol/L組在12，24，48 h時對SGC-7901細胞的增殖抑制作用呈現遞增趨勢，細胞的調亡率遞增，并且隨時間的延長而逐漸增高，在48 h時細胞的抑制率凋亡率達到最大。同時在12，24，48 h時，各濃度處理組對SGC-7901細胞的增殖抑制凋亡率從小到大依次是6.43%，14.39%，34.51%，45.05%，53.41%，7.58%，31.81%，42.04%，46.59%，57.95%，29.72%，44.47%，51.84%，60.6%，74.77%。表1為MTT法檢測藥物不同作用時間對SGC－7901細胞的增殖抑制作用。

圖1 SGC-7901細胞隨加藥濃度變化凋亡率曲線

2.2 Hoechst染色觀測細胞凋亡

Hoechst33258染色結果如圖2所示。圖2（a）～（f）分別為對照組、濃度為10 mmol/L藥物處理組、濃度為15 mmol/L藥物處理組、濃度為20 mmol/L藥物處理組、濃度為25 mmol/L藥物處理組、濃度為30 mmol/L藥物處理組；藥物α-乳白蛋白油酸復合物作用于SGC-7901細胞48 h后，利用熒光顯微鏡在紫外光源激發下觀察細胞經藥物作用的形態變化。發現對照組的細胞在鏡下可見生長旺盛，并且長勢均勻。細胞核成圓形或橢圓形，染色均勻，全部呈現藍色或淡藍色熒光。藥物處理組細胞均出現典型的細胞凋亡特征，細胞核固縮濃染，可見高度點狀白色熒光現象。呈高度點狀白色熒光的細胞比例隨著藥物α-乳白蛋白油酸復合物的濃度的遞增而增大。其中，濃度為10 mmol/L藥物處理組細胞與對照組比較變化不大，有少量的SGC-7901細胞呈現細胞凋亡現象，高濃度藥物處理組細胞核被染成高度點狀白色熒光的細胞逐漸增多，說明凋亡的細胞也相應的增多。

表1 不同時間對SGC－7901細胞的增殖抑制作用的檢測結果

圖2 Hoechst33258染色結果

2.3 瓊脂糖凝膠電泳

圖8為DNA瓊脂糖凝膠電泳圖。圖8中，條帶從左至右分別為對照組、濃度為10 mmol/L藥物處理組、濃度為15 mmol/L藥物處理組、濃度為20 mmol/L藥物處理組、濃度為25 mmol/L藥物處理組和30 mmol/L藥物處理組；藥物α-乳白蛋白油酸復合物作用于SGC-7901細胞48 h后，濃度為10 mmol/L藥物處理組的細胞DNA梯狀條帶不是十分明顯，從濃度為15 mmol/L藥物處理組至濃度為30 mmol/L藥物處理組細胞DNA梯狀條帶逐漸明顯，并且梯形條帶逐漸增多，說明從藥物低濃度至高濃度處理組細胞凋亡率逐漸增強。

圖8 DNA瓊脂糖凝膠電泳結果

3 討論

近半個世紀以來，國內外學者對胃癌的治療進行了廣泛而深入研究，取得許多重要進展，化療﹑放療是直接針對病灶部位采取的治療方法，雖然效果比較顯著，但是對人體傷害極大，但是目前胃癌臨床診治狀況仍處于早期診斷率低、手術切除率低、5年生存率低的局面。隨著胃癌治療技術的進步和人們觀念改變，天然藥物正在逐漸被人們認可，它在胃癌治療方面正在慢慢地取代化學藥物的地位，用自然存在的復合物作為化學預防和化學療法的方法逐漸成為重要的戰略。

從實驗結果可以看出，α-乳白蛋白油酸復合物對胃癌SGC-7901細胞的增殖具有顯著的抑制和促凋亡作用，尤其是當給藥濃度均大于15 μmol/L時，藥物處理組與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)，說明該復合物具有明顯的抑制胃癌的作用。且其增殖抑制作用還具有明顯的量效關系，隨著給藥濃度的增加，胃癌細胞的凋亡率也明顯增高。

因此，乳白蛋白油酸復合物的抗癌功能的發現，對胃癌治療和預防的簡單化、低廉化、無害化具有著重要的意義。如果能將實驗所制藥物廣泛添加于食品和藥品中，那會將使胃癌甚至于其它腫瘤的預防和治療向對人體完全無害化的方向邁出更重要的一步。

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Effects of compounds of alpha lactalbumin and oleic acid on proliferation and apoptosis of gastric carcinoma cell line SGC-7901

CUI Wei-wei，XU Xiao-xi,WANG Hong，ZHUO Zhi-guo
(College of Food Science,Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；)

In this paper，MTT was used for cell proliferation，Hoechst33258 staining was used to observe morphology and apoptosis and DNA gel electrophoresis was used to observe ladder-shaped band.Accordingly，we researched the effect of gastric carcinoma SGC-7901cell proliferation with oleic acid-induced milk alpha lactalbumin in different time and by different concentration.The results showed that alpha lactalbumin-oleic acid complex has a conspicuous role to induce apoptosis in gastric carcinoma SGC-7901 cells.

lactalbumin；oleic acid；apoptosis；gastric carcinoma

Q93-33

A

1001-2230（2011）05-0018-03

2010-12-21

黑龍江省教育廳青年骨干支持計劃項目（1153G005），黑龍江省教育廳創新團隊建設計劃（2010td11），黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃項目。

崔巍巍（1986-），女，碩士研究生，研究方向食品科學。

許曉曦