維生素A對穩定期COPD患者細胞因子表達的影響Δ

汪俊，余曉丹，劉曉，劉波，徐敏，楊敏麗，李可可，代織文，邵勇（.成都市第五人民醫院，成都市 630；2.重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶市 40006）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種常見、多發、高致殘率和高致死率的慢性呼吸系統疾病；是以氣道的炎癥反應為中心的疾病，且氣道炎癥反應貫穿疾病的各個階段。COPD患者慢性炎癥的特征是中性粒細胞、巨噬細胞和CD8+淋巴細胞在氣道腔、氣道壁和肺實質的聚集，這些炎癥細胞釋放不同的炎癥因子（如，腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8以及白三烯（LT）B4等）從循環系統中趨化炎癥細胞，放大炎癥效應，誘導結構改變，與氧化應激和蛋白酶/抗蛋白酶失衡等機制共同作用，促進COPD的發生、發展[1]。穩定期COPD患者誘導痰中性粒細胞數以及IL-8、IL-6、IL-10與TNF-α均明顯高于正常對照[2]。上皮細胞是參與炎癥過程的效應細胞，其可以促進白細胞的特異性聚集，在中性粒細胞遷移、滯留和活化過程中起作用。維生素A（VA）對維持氣道上皮的完整性，預防氣道細菌感染有重要的作用，因此VA缺乏會影響COPD患者以中性粒細胞為主的炎癥反應。既往對VA缺乏的幼兒研究及哮喘動物模型均證實，補充VA能降低炎癥因子水平。從理論上推測，給予VA補充治療后可降低COPD患者氣道內及系統的炎癥反應。本研究基于上述理論，研究了COPD患者血清VA水平與誘導痰及血清中細胞因子（IL-8、TNF-α、IL-1β）的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年12月－2010年6月成都市第五人民醫院呼吸科COPD數據庫中穩定期COPD患者100例為研究對象，所有研究對象符合GOLD COPD診斷標準[3]，中途退出及失訪者16例，共完成84例。其中，男性44例，女性40例，平均年齡67.8歲，輕度、中度、重度、極重度患者的比例為1∶1∶1∶1。所有患者隨機均分為對照組、治療1組和治療2組，3組患者的性別、年齡、病情程度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

所有患者采用比利時麥迪肺功能測試儀測定入組時血清VA、血及誘導痰細胞因子（IL-8、IL-1β、TNF-α）水平。所有患者均給予常規治療。治療1組在此基礎上加服VA膠丸（青島雙鯨藥業有限公司，規格：5 000 u，批號：100114）5 000 u，qd；治療2組加服10 000 u VA（生產廠家，規格同治療一組），qd。于入組后1個月、3個月、6個月進行隨訪，隨訪時再次進行上述指標的檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1 血清VA測定方法 采集靜脈血2 mL，避光保存，離心，取血清0.2 mL，加入0.2 mL乙醇沉淀蛋白后，用5 mL正己烷振蕩提取1 min，取正己烷層氮氣揮干，殘渣用0.1 mL甲醇溶解，15 000 r·min－1離心，取上清液進樣測定血清VA濃度。色譜條件：Agilent HP1100高效液相色譜儀，C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex，USA）；流速：1.0 mL·min－1；流動相：純甲醇；檢測波長：325 nm；柱溫：25℃。

1.3.2 痰的誘導和制備[4]誘導前先用肺功能儀測定1 s用力呼氣容積（FEV1）和用力肺活量（FVC），重復3次，取最佳值。研究對象以清水漱口，首先預防性吸入沙丁胺醇氣霧劑（葛蘭素史克制藥公司，規格：50 mg）200 μg，防止吸入高滲鹽水引起的氣道痙攣，然后超聲霧化吸入3%氯化鈉溶液[5]15 min后深咳痰液，此后每3 min深咳1次，共20～30 min。要求收集的痰液量至少＞1 mL。在吸入過程中密切觀察受檢者狀況，若在操作過程中出現哮喘癥狀或癥狀加重則暫停吸入。

將合格標本（鏡檢見鱗狀上皮細胞占有核細胞比例＜20%，即為合格標本）加入4倍于痰量的0.1%二硫蘇糖醇（DTT）37℃震蕩30 min，再加入4倍痰量的磷酸鹽緩沖液，通過60 μm的尼龍網過濾，2 000 r·min－1離心10 min，吸取上清液于－70℃冰柜保存。

1.3.3 血樣收集與處理 3組患者取空腹靜脈血3 mL各2管，其中一管中加有10%EDTA-Na2用于TNF-α的檢測，采血后立即1 500 r·min－1離心去除細胞，取1.0 mL血清，加入10 μL抑肽酶，搖勻，－70℃冰柜保存，待測；另一管中不加入抗凝劑和抑肽酶，采血后立即分離血清，－70℃冰柜保存，待測。

1.3.4 細胞因子的檢測方法 IL-8、IL-1β、TNF-α水平測定均采用放射免疫分析，試劑盒購自北京北方生物技術研究所，按說明書操作。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件處理，各組計量資料前、后比較采用t檢驗，多組間均數進行方差分析，各組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療前后血清中VA水平的比較

治療前，3組VA水平均低于正常人，3組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。治療1個月后，各組VA水平較治療前無明顯變化（P＞0.05）。治療3個月后，2個治療組VA水平分別較治療前顯著提高（P＜0.05），并且3組患者VA含量兩兩比較差異均有統計學意義，2個治療組均高于對照組（P＜0.05），治療2組明顯高于治療1組（P＜0.05）。治療6個月后，2個治療組患者VA水平較治療3個月時明顯增加（P＜0.05），且3組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。治療前、后血清中VA水平詳見表1。

表1 治療前后血清中VA水平（mg·mL－1，±s）Tab 1 Levels of vitamin A in serum before and after treatmen（tmg·mL－1，±s）

表1 治療前后血清中VA水平（mg·mL－1，±s）Tab 1 Levels of vitamin A in serum before and after treatmen（tmg·mL－1，±s）

組別對照組治療1組治療2組例數/n 28 28 28治療前0.34±0.10 0.31±0.09 0.30±0.12治療1個月后0.35±0.15 0.32±0.11 0.35±0.08治療3個月后0.32±0.11 0.41±0.15 0.48±0.17治療6個月后0.36±0.13 0.48±0.08 0.56±0.13

2.2 治療前后誘導痰中細胞因子的比較

治療前，3組誘導痰中細胞因子水平無顯著性差異（P＞0.05）。治療1個月后，各組誘導痰中細胞因子水平較治療前無明顯變化（P＞0.05）。治療3個月后，2個治療組細胞因子水平均較治療前有所下降（P＜0.05），但3組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。治療6個月后，2個治療組細胞因子水平均較治療3個月時明顯下降，且3組兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；2個治療組細胞因子水平均明顯低于對照組（P＜0.05），治療2組明顯低于治療1組（P＜0.05）。治療前、后誘導痰細胞因子水平詳見表2。

表2 治療前后誘導痰細胞因子水平（ng·mL－1，x ±s）Tab 2 Cytokines levels of induced sputum before and after treatmen（tng·mL－1，±s）

表2 治療前后誘導痰細胞因子水平（ng·mL－1，x ±s）Tab 2 Cytokines levels of induced sputum before and after treatmen（tng·mL－1，±s）

細胞因子IL-1β IL-8 TNF-α組別對照組治療1組治療2組對照組治療1組治療2組對照組治療1組治療2組治療前1.63±0.26 1.61±0.56 1.57±0.58 3.73±1.44 3.64±1.89 3.34±1.20 31.12±9.83 30.58±8.71 29.14±7.19治療1個月后1.59±0.31 1.57±0.61 1.55±0.34 3.69±1.23 3.71±1.75 3.56±1.08 26.23±9.03 18.32±7.56 16.29±8.51治療3個月后1.62±0.29 1.37±0.42 1.32±0.35 3.65±1.08 3.15±1.31 3.06±1.27 32.08±8.78 24.51±7.98 22.15±6.51治療6個月后1.67±0.35 1.22±0.28 1.09±0.21 3.57±1.74 2.36±1.39 2.08±1.32 33.45±9.32 20.95±8.41 16.51±6.87

2.3 治療前后血清中細胞因子的比較

治療前，3組血清中細胞因子水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。治療1個月后，細胞因子水平較治療前無明顯提高，且3組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。治療3個月后，2個治療組細胞因子水平均較治療前有所下降（P＜0.05），但3組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。治療6個月后，2個治療組細胞因子水平均較治療3個月時明顯下降（P＜0.05），3組兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；2個治療組均明顯低于對照組（P＜0.05），且治療2組明顯低于治療1組（P＜0.05）。治療前、后血清中細胞因子水平詳見表3。

表3 治療前后血清中細胞因子水平（ng·mL－1，x ±s）Tab 3 Cytokines levels of serum before and after treatmen（tng·mL－1，±s）

表3 治療前后血清中細胞因子水平（ng·mL－1，x ±s）Tab 3 Cytokines levels of serum before and after treatmen（tng·mL－1，±s）

細胞因子IL-1β IL-8 TNF-α組別對照組治療1組治療2組對照組治療1組治療2組對照組治療1組治療2組治療前0.33±0.15 0.32±0.13 0.35±0.09 0.64±0.20 0.62±0.18 0.59±0.17 26.21±10.0 25.02±9.27 27.00±10.84治療1個月后0.31±0.12 0.35±0.17 0.37±0.11 0.67±0.17 0.64±0.13 0.61±0.15 25.74±9.57 24.87±8.69 26.32±9.10治療3個月后0.35±0.15 0.28±0.11 0.26±0.08 0.64±0.18 0.52±0.18 0.49±0.11 26.23±9.03 18.32±7.56 16.29±8.51治療6個月后0.37±0.11 0.22±0.09 0.16±0.11 0.60±0.23 0.46±0.13 0.39±0.07 25.49±8.71 15.29±7.91 12.57±6.95

3 討論

COPD是由有毒顆粒和氣體（主要是吸煙）引起的肺部炎癥及全身效應性疾病，不完全可逆的進行性的氣流受限是其主要特征。其病理組織學特點是氣道上皮細胞、上皮下網狀結構、平滑肌細胞和杯狀細胞黏液腺等，因慢性炎癥而發生結構破壞與修復，產生氣道管壁增厚變形，以平滑肌增厚最顯著，導致氣道管腔狹窄和氣道阻力增加，形成氣道重塑。產生這一系列病理生理改變的主要環節之一是慢性氣道炎癥[6]。

VA在維持機體正常功能、調節物質代謝和維持生理功能等方面發揮著重要作用，具有促進生長、消除炎癥、調節免疫、維持細胞結構的功能，在呼吸系統的發生、發展中具有重要作用。從動物模型到人體試驗均證實[7]，VA能促使肺泡上皮的修復。VA水平低下可能對機體產生以下影響：（1）呼吸道黏膜中纖毛柱狀上皮細胞消失，并出現鱗狀上皮化生、表層角化、脫落阻塞管腔，且腺體失去正常功能、分泌物減少、肺彈性減低、局部非特異性免疫功能降低，病毒或細菌易侵入人體內引起繼發感染；（2）影響呼吸道黏膜，使其分泌型免疫球蛋白（SI-gA）分泌減少，從而影響局部免疫功能；（3）可導致細胞免疫功能受損，淋巴細胞轉換受到明顯影響；（4）可使類固醇激素合成發生障礙及淋巴細胞抑制，降低抗過敏、抗感染的能力[8]。VA對維持氣道上皮的完整性，預防氣道細菌感染有重要的作用，而COPD患者的氣道上皮細胞是參與炎癥過程的效應細胞，可以促進白細胞的特異性聚集，并且通過表達重要的中性粒細胞黏附配體，重組人細胞間黏附分子（ICAM-1）在中性粒細胞遷移、滯留和活化過程中起作用。因此，VA缺乏會影響COPD患者以中性粒細胞為主的炎癥反應。

大多數人認同，VA缺乏會影響患兒氣道上皮細胞的完整性，導致患兒反復呼吸道感染；VA補充后能明顯增加幼兒巨噬細胞和中性粒細胞的功能，影響細胞因子IL-1、TNF-α的合成[9]。對哮喘動物模型的研究也證實，VA與哮喘的炎癥反應有關。陳慧敏等[10]對哮喘豚鼠的研究表明，補充VA可以減輕哮喘的炎癥反應，在一定范圍內隨VA攝入量增加，效果更顯著。方紅等[11]對哮喘大鼠的研究得出類似結論，并認為VA對減輕哮喘的炎癥反應的作用與TNF有關。近年來，VA在COPD中的作用在理論以及動物實驗方面得到了多數學者的認可，但是仍然有研究得出不同的結論，并且針對COPD患者的研究資料較少。2003年，Lucey EC等[12]發表文章稱，全反式維甲酸治療并不能夠改善成年肺氣腫模型大鼠氣道的大小，也不會影響彈性蛋白酶及前膠原mRNA的表達。2004年，Fujita M等[13]的實驗也發現視黃醇并不能對大鼠的肺氣腫產生有益的影響，認為VA應用于COPD患者對其癥狀以及肺功能的改善作用并不讓人滿意，可能的原因在于沒有在疾病早期意識到營養支持的重要性并進行補充。VA缺乏在COPD患者中普遍存在，10種老年慢性疾病VA水平分析[14]中發現，肺氣腫和肺心病是發生VA缺乏率最高的疾病，分別達到了51.5%和91.6%。并且吸煙等因素導致VA的消耗過多，給予一定劑量的VA補充是必要而且安全的。Mao JT等[15]對嚴重肺氣腫患者給予3個月VA治療，結果表明，患者對VA的耐受性較好、不良反應輕，并認為進一步的研究應該了解高劑量、長時間及不同劑量的可行性。

本課題組的前期研究已經對穩定期COPD患者以及健康吸煙成人誘導痰和血清中的IL-8、IL-1β、TNF-α水平及血清中VA水平進行了測定。結果顯示，穩定期COPD患者誘導痰和血清中IL-8、IL-1β、TNF-α較健康吸煙組均升高，本地區穩定期COPD患者血清VA的濃度低于正常成年人（0.56±0.12）mg·L－1，差異具有統計學意義（P＜0.05），這表明COPD患者中存在系統性炎癥反應。這種改變不僅與支氣管-肺組織的慢性炎癥有關，而且可加劇COPD的嚴重程度并可造成全身炎癥反應。同時也提示，穩定期COPD患者具有較低的VA水平。本研究在此基礎上對穩定期COPD患者補充VA，觀察其能否調節COPD關鍵細胞因子的表達，進而延緩病程的進展。結果顯示，補充VA后，2個治療組患者血清VA的濃度均有不同程度的上升，服藥劑量越大、時間越長，血清VA濃度上升越明顯。補充VA1個月后，細胞因子水平較治療前無明顯增加，且3組間比較無統計學差異（P＞0.05）；3個月后，2個VA治療組細胞因子水平分別較治療前有所下降（P＜0.05），2組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；6個月后，2個治療組細胞因子水平較3個月隨訪時進一步下降，治療2組下降較治療1組更明顯（P＜0.05）。由此可以看出，VA可以下調穩定期COPD患者誘導痰和血清中IL-8、IL-1β、TNF-α的表達水平。TNF-α是細胞因子級聯反應的初級因子和觸發成分，可使上皮細胞、巨噬細胞和肺組織的核因子-κB（NF-κB）活性增強，并誘導血管細胞黏附因子（VCAM-1）的表達，而VCAM-1參與炎癥過程中淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞的黏附和浸潤[16，17]，引起肺損傷，并誘導產生一系列的細胞因子。IL-1β主要由活化的單核-巨噬細胞產生，是機體前炎癥免疫反應的主要誘導劑。IL-8是其中最重要的趨化和激活中性粒細胞（PMN）的細胞因子，主要由單核巨噬細胞在IL-1、TNF-α等誘導下合成與釋放[18]。由此推測，VA可能是通過抑制TNF-α的表達[19]，進而抑制其他細胞因子的表達，起到抗炎作用的。

綜上所述，VA類物質作為一類具有多相性調節作用的物質，對各種炎癥、免疫和結構細胞的功能均有調節作用。提高對此類物質廣泛生理調節作用的認識，將為COPD的防治提供新的思路。

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