畢赤酵母表達風味強化肽的分離與純化

田 雪，張寶持，白小佳，王艷萍

(食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

畢赤酵母表達風味強化肽的分離與純化

田 雪，張寶持，白小佳，王艷萍

(食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

為了開發新型風味強化劑，采用硫酸銨分段鹽析法、中空纖維超濾、陰離子交換樹脂分離等方法，對構建的工程菌P.,postoris GS115-16B2發酵表達的16拷貝風味強化肽的分離純化效果進行研究.實驗結果表明，分離純化最佳方法為：首先使用中空纖維進行超濾濃縮，經過兩次稀釋過濾濃縮后的濃縮液再采用離子交換樹脂 DEAE–52進一步分離純化.經SDS-PAGE檢測，純化后16拷貝風味強化肽的平均純度可達93.19%.

畢赤酵母；風味強化肽；鹽析；中空纖維超濾；離子交換樹脂；分離純化

風味強化肽最初是從牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分離得到的一種八肽，它與食鹽、味精有較好的協同呈味作用，并且具有很好的熱穩定性，適合于食品工業生產中的熱處理要求.因此，風味強化肽有望代替味精成為新一代風味強化劑，具有廣闊的市場前景.

隨著分子生物學的發展和應用，數百種外源蛋白實現了在畢赤酵母、釀酒酵母等表達體系中的成功表達[1–2]，然而發酵液中目的蛋白難以分離純化已成為影響其應用的主要問題.尤其是各種肽，由于其分子質量小，表達出來的產物難于分離[3].

本實驗室構建出帶有16拷貝風味強化肽的高效表達載體，并將其整合到畢赤酵母(Pichia pastoris)進行誘導表達[4].本文在前期工作的基礎上，對構建的工程菌P. postoris GS115-16B2發酵表達的16拷貝風味強化肽的分離純化方法作了探索性嘗試，即分別運用硫酸銨分段鹽析法、中空纖維超濾、陰離子交換樹脂分離方法和兩步分離法進行分離純化，尋找出較好的分離純化工藝.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Pichia pastorisGS115-16B2，畢赤酵母基因組整合有16拷貝風味強化肽基因，由本實驗室保存.

1.1.2 試劑與儀器

外源蛋白發酵樣品由本實驗室制備；DEAE–52陰離子交換樹脂，南開大學化工廠；硫酸銨(分析純)，天津市天大化工實驗廠.

中空纖維超濾膜(截留相對分子質量為 6,000、60,000)，天津膜天膜公司；Power,PAC,3000電泳儀和全自動凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司.

1.2 方法

1.2.1 發酵液預處理

將收集到的發酵液在 6,000,r/min離心 20,min，除去大部分菌體，然后加熱到 100,℃煮沸 5,min，使大部分蛋白酶失活，迅速降溫，于－20,℃儲存備用.

1.2.2 硫酸銨分段鹽析

一級鹽析：取發酵上清液適量分裝，每瓶200,mL.將硫酸銨烘干研細，按質量分數為 30%、35%、40%、45%、50%和 55%向發酵上清液中緩慢加入硫酸銨，不斷攪拌至完全溶解，4,℃靜置 2,h，6,000,r/min、4,℃離心 20,min，沉淀溶于蒸餾水中，透析，SDS-PAGE檢測，找到目標蛋白16拷貝風味強化肽沉淀較少而雜蛋白沉淀最多時的硫酸銨質量分數.

二級鹽析：取發酵上清液適量，按照一級鹽析的最適硫酸銨質量分數鹽析，然后將離心得到的上清液分裝，每瓶 200,mL.向上清液中緩慢加入硫酸銨粉末，不斷攪拌至完全溶解，使硫酸銨質量分數分別為60%、70%、80%和 90%.4,℃靜置 2,h，6,000 r/min、4,℃離心20 min，棄上清液，將沉淀溶于蒸餾水中，透析，并取相對應的上清液進行透析，SDS-PAGE檢測.

1.2.3 發酵上清液的中空纖維超濾

將預處理過的發酵液通過截留相對分子質量為60,000的中空纖維超濾膜，將小于60,000的超濾液再通過截留相對分子質量為6,000超濾膜，收集相對分子質量大于6,000的濃縮液，保存于－20,℃冰箱中.

1.2.4 陰離子交換層析分離

采用 DEAE–52層析柱(1.0,cm×40,cm)，流量為0.5,mL/min，用4～5個柱體積的緩沖液平衡層析柱，含 NaCl 濃度分別為 0、0.10、0.15、0.20、0.25,mol/L的Tris-HCl(pH,7.0)緩沖液進行梯度洗脫.

回收率＝(洗脫液中蛋白質量濃度×體積)/(原液蛋白質量濃度×體積)×100%

1.2.5 蛋白質量濃度與蛋白含量的測定方法

應用 Bradford法[5]測定發酵液總蛋白質量濃度.SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白含量[6].

2 結果與討論

2.1 硫酸銨分段鹽析

2.1.1 一級鹽析的確定

將預處理后的發酵液用 HCl或 NaOH調節 pH至等電點 3.94.以硫酸銨作為鹽析劑，在不同鹽析質量分數下對16拷貝風味強化肽進行分段鹽析沉淀實驗，結果如圖1所示.

圖1 硫酸銨鹽析16拷貝風味強化肽沉淀SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of 16 copies flavor enhancing peptide precipitation by ammonium sulfate salting

目的蛋白相對分子質量為 2.5×104，從圖 1可知，當硫酸銨質量分數為 45%以下時，蛋白沉淀較少，當達到50%時，開始出現較多的沉淀.因此，本研究選擇一級鹽析時硫酸銨質量分數為45%.

2.1.2 二級鹽析

選擇硫酸銨質量分數 45%進行一級鹽析，通過SDS-PAGE檢測，結果如圖2所示.

圖 2 硫酸銨二級鹽析 16拷貝風味強化肽沉淀 SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of 16 copies flavor enhancing peptide precipitation by ammonium sulfate salting

結合圖 1和圖 2可知，當硫酸銨質量分數為45%～60%時，蛋白質的溶解度隨溶液質量分數的增加而降低，沉淀蛋白電泳條帶越來越濃，當在 70%～90%時，硫酸銨溶液質量分數增加而沉淀蛋白電泳條帶相對變稀.為了得到更多的沉淀蛋白，本研究選擇二級鹽析時硫酸銨質量分數為60%.

采用硫酸銨鹽析的方法在粗提階段提高所需蛋白純度，這在很多相關文獻中都有提及，如羅磊等[6]的“一步沉淀法”，Siegelman等[7]的“分步沉淀法”，胡一兵等[8]的“分段梯度鹽析法”，但這些方法或產物純度低，或重復性差，或鹽析次數多，或鹽析段過于狹窄等.本實驗首先進行 0%～45%的硫酸銨鹽析，這段沉淀物可以拋棄(去除大多數雜質)；然后進行 45%～60%的硫酸銨鹽析，可以得到較好的鹽析效果.但是從圖1和圖2可以看出，當硫酸銨飽和度為 60%～90%時，上清液中仍然含有大量純度較高的目標蛋白，回收率太低，因此放棄使用硫酸銨鹽析的方法進行粗分，并且嘗試使用中空纖維方法分離、濃縮目標風味肽.

2.2 發酵上清液的中空纖維超濾

稀釋過濾即是在膜分離過程中向料液中加入滲透溶劑(一般是水)，使小分子和滲透溶劑一起去除，直到達到所需要的分離要求.顯然，如果產品是大分子，稀釋過濾類似于洗滌；而當產品是小分子時，產品液體將被稀釋.因 16拷貝風味強化肽相對分子質量小于 60,000，當通過截留相對分子質量 60,000的超濾膜時，是將溶液中的大分子雜質去除.為了提高16拷貝風味強化肽的回收率，必須采用稀釋過濾.圖3為中空纖維超濾膜濃縮后發酵液的 SDS-PAGE凝膠電泳圖.

圖3 中空纖維分離液SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of hollow fiber separation

3、8和12泳道為濃縮后相對分子質量在6 000～60,000樣品，其蛋白濃度明顯比 5號對照泳道深，說明經過中空纖維超濾膜濃縮后，16拷貝風味強化肽目的蛋白被高效濃縮；4、9和 13泳道蛋白條帶很淡甚至沒有條帶，說明 6,000濾出液只含有少量的蛋白，達到很好的超濾濃縮效果.

2.3 離子交換樹脂DEAE-52純化16拷貝風味強化肽濃縮液

圖4 洗脫液鹽濃度對DEAE-52分離16拷貝風味強化肽影響Fig.4 Effect of eluent salt concentration on the separation of 16 copies flavor enhancing peptide by DEAE-52

通過預備實驗，選擇緩沖液pH為7.0，檢測洗脫液在220,nm下的吸收峰，得到洗脫曲線如圖4所示.圖 4結果顯示，Tris-HCl-NaCl梯度洗脫曲線在8、19、30、40和 49號管分別出現較高吸收峰，選擇這些吸收峰以及其附近的洗脫液，進行 SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖5所示.

圖5 16拷貝風味強化肽洗脫峰SDS-PAGE電泳結果Fig.5 SDS-PAGE of 16 copies flavor enhancing peptide elution peak

根據圖 5可知，目標蛋白在第 40～49管洗脫液中析出，此時 NaCl濃度為 0.25,mol/L，其中 46～49管洗脫液樣品純度較高.

2.4 兩步分離純化

首先使用中空纖維進行超濾濃縮，濃縮分別經過兩次超濾，得到相對分子質量在 6,000～60,000的蛋白質，考馬斯亮藍結果顯示其蛋白質量濃度為6.34,g/L，回收率達到 59%；采用 DEAE–52進行進一步分離純化，經 SDS-PAGE檢測，純化后 16拷貝風味強化肽平均純度可達 93.19%.將得到最佳的結果進行SDS-PAGE電泳，結果如圖6所示.

圖6 兩步分離純化結果的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of the separation and purification results

3 結 語

蛋白質分離純化很難用單一方法實現，往往要綜合幾種方法才能提純出一種蛋白質[9].理想的蛋白質分離提純方法要求產品純度和總回收率越高越好，但實際上兩者難以兼顧，因此，考慮分離提純的條件和方法時，不得不在兩者之間作適當的選擇；一般情況下，科研上更多地選擇前者，工業生產上更多地選擇后者.因此，每當需要提純某種蛋白質時，首先要明確分離純化的目的和蛋白質的性質，以便選擇最佳的分離純化方法，從而得到理想的效果[10].

本研究將預處理過的發酵液進行分離純化.分別采用了硫酸銨鹽析法、中空纖維超濾法和 DEAE–52進行純化.經過實驗確定最佳方法為：首先使用中空纖維進行超濾濃縮，濃縮分別經過兩次超濾，通過截留相對分子質量分別為60,000和6,000的膜，得到相對分子質量范圍在 6,000～60,000之間的蛋白質，回收率達到 59%；采用 DEAE–52進一步分離純化，經SDS-PAGE檢測，純化后16拷貝風味強化肽平均純度可達93.19%.

［1］Shi X，Karkut T，Chamankhah M，et a1. Optimal conditions for the expression of a single-chain antibody(scFv)gene in Pichia pastoris[J]. Protein Expr Purif，2003，28(2)：321–330.

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Separation and Purification of Flavor Enhancing Peptide fromPichia Pastoris

TIAN Xue，ZHANG Bao-chi，BAI Xiao-jia，WANG Yan-ping
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

The separation and purification method of 16 copies flavor enhancing peptide fromPichia Pastorisfermentation broth was studied by fractional salting out，hollow fiber ultra filtration and anion exchange resin. The results showed the best separation and purification method. The broth was first ultra filtration enriched twice by hollow fiber column，and then further purified by ion-exchange resin DEAE-52. After the purification，the average purity of 16 copies flavor enhancing peptide was 93.19% detected by SDS-PAGE.

Pichia pastoris；flavor enhancing peptide；salting-out；hollow fiber ultra filtration；ion exchange resin；separation and purification

Q503

A

1672-6510(2011)04-0014-04

2011–02–18；

2011–03–15

天津市東麗區科技創新專項資金項目(20101306)；天津市科技發展計劃(05YFGHHZ00200)

田 雪（1985—），女，天津人，碩士研究生；通信作者：王艷萍，教授，博士生導師，ypwang@tust.edu.cn.