不同處理方式對紅松愈傷組織誘導及增殖的影響

曹 焱 戴偉男 戴鳳海

(1.黑龍江林業科學研究所，哈爾濱 150081；2.黑龍江省林木種苗管理總站，哈爾濱 150090)

紅松(Pinuskoraiensis)合子胚愈傷組織誘導是紅松離體再生研究的前期準備，也是通過體細胞胚胎發生途徑進行植株再生的重要基礎。筆者經過大量試驗，誘導出形態各異的紅松愈傷組織，可旺盛增殖，但絕大多數最終不能分化出具有胚性感受態的細胞組織，因此有效愈傷組織的增殖與更新則成為針葉樹體細胞胚胎發生的一個關鍵環節[1]。根據Arm strong標準將得到的愈傷組織分為3類：I型，結構致密、復雜多樣、生長緩慢，通過器官發生途徑分化芽和根，產生胚狀體較少，不易長期繼代；Ⅱ型，結構松散、易碎、呈顆粒狀、生長較快，長期繼代仍有胚性，能通過胚狀體途徑再生；Ⅲ型，結構粘軟、水浸狀、白色透明或半透明，容易繼代培養，但幾乎喪失分化能力，為非胚性愈傷組織[2]。試驗中，我們根據Arm strongⅡ型愈傷組織的標準，來辨識哪些是有效愈傷組織，并對此進行繼代培養。

1 材料和方法

1.1 材料

取紅松成熟種子，采種地點為黑龍江省哈爾濱市阿城區小嶺林場。紅松人工林樹齡30a左右，現已結實7a。采種后置于4℃冰箱低溫保存4周后進行接種。

1.2 方法

1.2.1 接種前材料處理

接種完整外植體前，將滅菌后的合子胚分別放置于蔗糖溶液(10、20、30、50、70g·L-1)、PEG 6000(50、70、100、200、450 g·L-1)、甘露醇水溶液(0.5、1、2、4、8mmol·L-1)浸泡處理24h后接種。比較不同處理對愈傷組織誘導的影響。

1.2.2 培養基中不同蔗糖濃度處理

其他條件不變，取愈傷組織小塊置于蔗糖濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的培養基中。觀察不同蔗糖濃度對愈傷組織增殖的影響。

1.2.3 添加ABA、PEG、甘露醇處理

在紅松愈傷組織增殖培養階段，研究ABA、PEG 6000和甘露醇對愈傷組織及有效愈傷組織增殖的影響。分別添加1、3、5、10、25g·L-1ABA；10、15、20、40、70 g·L-1PEG 6000；0.5、1、2、5、10g·L-1甘露醇。

所有處理均設3次重復，每個培養皿3～10個外植體，室溫23～25℃，濕度大于60%。暗培養。4～6周繼代一次。

1.2.4 數據獲得及統計分析方法

試驗中獲得的各種愈傷組織均用解剖鏡觀察外部形態，并記錄、拍照。試驗數據采用Excel 和SPSS軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 接種前處理對紅松愈傷組織誘導的影響

接種之前，將滅菌后的完整胚分別置于各濃度的甘露醇溶液(M)、PEG 6000溶液(PEG)和蔗糖溶液(Su)中，浸泡24h后，取出外植體均接種于LM基本培養基添加2mg·L-12,4-D、0.5mg·L-16-BA、0.5mg·L-1TDZ。起初的2周內外植體無愈傷組織產生，整個外植體變白并膨大，15d后逐漸產生愈傷組織，形態多為疏松水漬狀，無色透明或半透明。45d愈傷大量分化，在沒更換培養基的情況下，60d仍能保持鮮活的狀態，褐化率極低。據此推斷，經過甘露醇、PEG 6000和蔗糖溶液處理的合子胚，其表面或內部細胞在外部物質的刺激下排列上發生變化，可以使得外植體幾乎處在同一時間脫分化，并在很大程度上減少了褐化率，放慢了褐化速度。后期培養發現，甘露醇處理好于PEG 6000和蔗糖溶液處理。綜合得出：對外植體進行甘露醇、PEG 6000和蔗糖溶液浸泡處理，均可以明顯提高愈傷組織的初始分化率和誘導量，并可以相對長時期保持愈傷組織的旺盛分化能力。

2.2 培養基中不同蔗糖濃度對紅松愈傷組織增殖的影響

蔗糖濃度不只對細胞增殖起作用，同時也是影響細胞分化的因素之一。將產生的紅松愈傷組織分小塊(直徑0.5～1cm)接種于添加0.5mg·L-12,4-D、0.2mg·L-16-BA的LM培養基中，分為1%、2%、3%、4%、5%的蔗糖濃度，以蔗糖濃度為3%的處理作為對照，繼代30d左右觀察增殖效果，試驗結果如圖1。不同蔗糖濃度對有效愈傷組織的增殖和保持能力不同，但差異不顯著(p<0.05)，說明蔗糖濃度對有效愈傷的增殖率影響不大。從增殖出的有效愈傷組織的外部形態來看：蔗糖濃度3%的處理產生的愈傷組織為淺黃色疏松、鮮活狀，有的還產生瘤狀小凸起，分化比較旺盛；蔗糖濃度在1%、2%時，表面產生細胞顆粒或絨毛狀細胞，這是營養供應較差、碳源供應不足的表現；蔗糖濃度在4%時增殖率偏低，原有愈傷組織轉變為團塊狀并且開始干燥，表明此種滲透壓過大，培養物吸收營養物質較為困難；蔗糖濃度在5%時，原愈傷組織褐化后重新分化出具有鮮活特性的有效愈傷組織，這表明在愈傷組織受到高滲透壓脅迫時，褐化的愈傷組織內部聚集了一定的活性物質，通過能量的轉化后產生新的有效愈傷組織，但這種變化發生的頻率較低。高滲透壓下外植體新陳代謝加快，導致大部分的愈傷組織褐化死亡。綜合看來，蔗糖濃度為3%的培養基對有效愈傷的增殖比較穩定。

2.3 培養基中添加ABA、PEG和甘露醇對紅松有效愈傷組織增殖的影響

ABA、PEG 6000和甘露醇被認為具有促進胚性愈傷組織誘導和增殖的作用，可以延緩甚至減少外植體所受脅迫的危害。以LM為基本培養基，不添加其他激素，將誘導出的愈傷組織分別繼代于添加1、3、5、10、25 g·L-1ABA，10、15、20、40、70g·L-1PEG 6000，0.5、1、2、5、10g·L-1甘露醇的各處理中，空白LM培養基作為對照，繼代30d后觀察增殖效果。

對照的有效愈傷增殖率為6.5%±4.2%。圖2～圖4分別顯示了添加不同活性物質后對有效愈傷組織增殖的作用效果。從圖中可明顯看到，添加了5g·L-1ABA的處理與對照及其他處理差異極顯著(p<0.01)，有效愈傷增殖率也為所有處理中最高，這表明5g·L-1ABA為較適宜的濃度。PEG 6000在10、15g·L-1時與對照差異顯著(p<0.05)，有效愈傷增殖率達到25%～26%，隨著PEG 6000濃度逐漸升高，有效愈傷組織增殖率急速下降，這表明PEG 6000濃度偏大，不適宜有效愈傷的誘導增殖，建議選在PEG 6000濃度為10～15g·L-1時增殖效果較好。甘露醇在0.5g·L-1時有效愈傷增殖率為顯著水平(p<0.05)，隨著濃度逐漸升高，先是急速下降，而后緩步上升，并趨近平穩，這表明應加入低濃度的甘露醇促進有效愈傷的增殖。

3 討論

3.1 接種前處理與有效愈傷組織的誘導

本試驗中經過蔗糖溶液、PEG 6000和甘露醇浸泡處理24 h的合子胚，在誘導過程中顯示出了不易褐化并且旺盛分化的效果。試驗中三種處理的外植體誘導率都達到了相當高的水平，說明經過處理的外植體其表面或內部結構發生了變化，對外界的刺激變得敏感，有利于愈傷組織的誘導。但到繼代培養的后期，愈傷組織雖增殖迅速，卻未見胚狀體的發生，因此對其是否能促進胚性愈傷組織的發生還需繼續探索。

3.2 蔗糖濃度與有效愈傷組織的增殖

在植物組織培養中蔗糖能支持大多數離體培養物的旺盛的生長，以至大多數合成培養基均以蔗糖作為唯一的碳源。因此，蔗糖的用量不僅影響培養物生長的速度和生長量，而且影響其代謝水平，次生代謝物的合成以及細胞形態和發生，是影響植物組織培養成功的關鍵[3]。本研究表明，當蔗糖濃度為2%時，有效愈傷組織誘導率最高，但有效愈傷組織不容易保持，容易在表面產生絨毛狀細胞；當蔗糖濃度高達5%時，在一定的培養時間內有效愈傷組織迅速增加，培養基中營養元素耗費加速，外植體新陳代謝加快，從而導致培養物迅速褐化；而當蔗糖濃度在3%時，有效培養物可保持較長時間，并不斷分化。由此可見，蔗糖濃度對提高有效愈傷組織的誘導頻率以及形成高質量的培養物尤為關鍵。

3.3 ABA、PEG和甘露醇與有效愈傷組織的增殖

本試驗中，添加了5g·L-1ABA的增殖培養基產生的有效愈傷達到極顯著水平，說明ABA可以促進有效愈傷組織的產生。PEG在10～15g·L-1的范圍也與其他濃度的誘導率達到顯著水平。之前曾說PEG有促進愈傷組織分化、刺激細胞生長、調節細胞狀態等優點，本試驗的結果驗證了這一理論。甘露醇只在0.5g·L-1的水平下，有效愈傷增殖達到了顯著水平。這表明，在愈傷組織的增殖培養中，添加適當濃度的具有調節細胞勢、滲透壓等的物質可提高愈傷組織的增殖率。

4 結論

接種紅松成熟合子胚之前，用蔗糖、PEG、甘露醇等高滲透壓的物質浸泡種子更有利于愈傷組織的誘導以及使產生的愈傷組織活性延長。紅松有效愈傷組織增殖階段，蔗糖濃度與一般樹種對碳水化合物的需求基本相同，最佳為3%；在培養基中加入適量的高滲透壓物質，可以促進紅松有效愈傷組織的增殖。

[1]王偉達,李成浩,楊靜莉,張含國.不同植物生長調節物質對雜種落葉松胚性愈傷組織增殖的影響[J].東北林業大學學報，2008,(9):5～7.

[2]曹昆,李霞.木本植物組織培養不定芽誘導研究[J].江蘇林業科技，2008,(10):43～48.

[3]Flowler MW, Wastson Rlyons. In Proc.5th Ind. Cong[M].Plant Tissue and Cell Culture,1982：225～228.