幽門螺桿菌cag4蛋白的原核表達、純化及鑒定①

王文凱 鐘 橋 謝立蘋 邵世和 (江蘇大學附屬人民醫院檢驗科,鎮江212002)

溶菌糖基轉移酶(Lytic transglycosylase,LT)廣泛分布于細菌,能夠水解N-乙酰胞壁酸酯(N-acetylmuramic acid,MurNAc)和 N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,G lcNAc)之間的β-1,4糖苷鍵。與溶菌酶不同的是其不是發生水解作用,而是發揮糖基轉移酶的活性,即在N-乙酰胞壁酸酯MurNAc內部形成了1,6糖苷鍵。由于該酶廣泛的參與細菌的分裂繁殖、生物被膜形成以及細菌毒性蛋白的轉運,因此與細菌的致病性密切相關[1]。其中,廣泛分布于細菌的Ⅲ、Ⅳ型分泌系統中的溶菌糖基轉移酶,可以水解肽聚糖層,使得胞內蛋白進入周漿間隙,促進分泌轉運裝置的裝配形成,從而使得細菌發揮毒性作用[2]。而在幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,簡稱 H.pylori)Cag致病島中,也編碼一個Ⅳ型分泌樣裝置,負責轉運毒性蛋白CagA進入宿主細胞,發揮毒性作用[3]。近年來,雖然Cag致病島Ⅳ型分泌樣裝置的研究取得了一定的進展,但該分泌裝置的裝配形成機制尚未明確[4]。其中,幽門螺桿菌cag4蛋白是 H.pylori Cag致病島編碼的溶菌糖基轉移酶,可以在局部水解細菌的肽聚糖層,使得胞內蛋白釋放進入周漿間隙,促進分泌系統的裝配形成。本文利用原核表達技術成功地獲得具有良好的水解活性的cag4重組蛋白,并對其酶活性和理化特性做了初步鑒定;旨在進一步闡明幽門螺桿菌致病機制,為新型抗生素(或是抗菌藥物)的研發提供作用靶位。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 H.pyloriNCTC11637由中國疾病控制中心傳染病預防研究所張建中教授饋贈,大腸埃希菌DH5α及BL21(DE3)、溶壁微球菌為江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院中心實驗室保存。

1.1.2試劑和儀器 哥倫比亞培養基、厭氧袋購自OXOID公司;Ex TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸內切酶 EcoR Ⅰ及 Xho Ⅰ、T4-DNA連接酶、IPTG、DL2000 DNA Marker及蛋白質分子量標準(低)購自TaKaRa公司;DL1Kb DNA marker購自金思特生物有限公司;Ni2+-NTA購自Qiagen公司;pGEM-T載體購自Promega公司;pET-28a載體由江蘇大學醫學技術學院中心實驗室保存;超速離心機購自Beckman公司;其他常規試劑按照《分子克隆實驗指南》要求配制。

1.2幽門螺桿菌cag4蛋白基因的克隆 根據幽門螺桿菌cag4蛋白基因的全長序列,設計上、下游引物：P1：5′-CGGG AATTCTTGTTTGGG AAATGG AT-3′;P2 ：5′-ATTCTCG AGCTACTCGTTATATCGCACTT-3′,在其5′端分別引入 EcoR Ⅰ、XhoⅠ酶切位點,PCR產物長度為510 bp。引物由上海生工生物技術有限公司合成。以 H.pyloriNCTC11637菌株基因組DNA為模板,用 Ex Taq聚合酶進行 PCR擴增(25μl反應體系)。擴增參數為：94℃5分鐘,94℃30秒、52℃30秒、72℃1分鐘,30個循環,72℃10分鐘。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,GeNius凝膠電泳圖像分析系統分析鑒定并用膠回收試劑盒回收PCR產物。

1.3T-A克隆和原核表達載體pET-28a-cag4的構建膠回收的 PCR產物與pGEM-T載體,加1μl T4-DNA連接酶,4°C連接過夜。連接產物轉化 E.coli DH5α感受態細胞。轉化后的細菌涂布于含50μg/ml氨芐青霉素的LB平板上,37℃培養16小時。挑取菌落轉種于含氨芐青霉素50μg/ml的LB液體培養基,37℃振搖12小時,用堿裂解法進行質粒提取,并進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。

膠回收酶切目的片段,構建表達pET-28a-cag4,轉化感受態細菌 E.coliBL21(DE3),轉化好的細菌涂布含100μg/ml卡那霉素的LB瓊脂培養基培養12～16小時,挑選單菌落接種于含卡那霉素的LB液體培養基中,置37℃搖床振蕩培養12小時,抽提質粒,酶切鑒定。

1.4蛋白誘導表達和鑒定 經酶切鑒定構建成功的重組工程菌,接種于含100μg/ml卡那霉素的LB液體培養基中,在37℃振蕩至菌液OD600達到0.6,加入 IPTG誘導后,收集菌液進行SDS-PAGE鑒定。同時,設立陰性對照。

取誘導后的菌液進行SDS-PAGE電泳后,然后4℃電轉移至PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉3小時,換新鮮的封閉液,加入鼠抗His單克隆抗體作為一抗,37℃搖床反應1小時。1×PBST洗滌3～5次,每次5分鐘,于1×PBST中加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔 IgG作為二抗,37℃搖床反應1小時,最后DAB顯色至目的條帶清晰時將膜轉移至雙蒸水終止反應。

1.5蛋白的純化和復性 通過比較不同誘導時間和IPTG濃度后,確定了最佳誘導條件,即1 mmol/L IPTG,誘導4小時。細菌活化后,按照1∶200稀釋后加入500 ml LB中,進行大量誘導。收集菌體后,重懸于 lysis buffer(50 mmol/L NaH2PO4·2H2O,300 mmol/L NaCl,5 mmol/L iminazole和8 mmol/L urea[pH8.0])中,冰上超聲破碎(200 W)。離心后,收集上清和鎳柱Ni2+-NTA(Qiagen)室溫結合1小時后純化。洗滌去除蛋白后,利用 Elute buffer(50 mmol/L NaH2PO4·2H2O,100 mmol/L NaCl,200 mmol/L imidazole,8 mmol/L urea,和 5 mmol/L DTT[pH8.0])進行洗脫,收集蛋白后,SDS-PAGE鑒定。

蛋白透析之前將透析袋放入含2%NaHCO3和1 mmol/L EDTA的蒸餾水中煮沸10分鐘,用蒸餾水反復沖洗,再放入含1 mmol/L EDTA的蒸餾水煮沸10分鐘,自然冷卻,加入待透析的蛋白,分別用含6、4、3、2和1 mol/L尿素 PBS在4℃條件下梯度透析,各4小時,最后用不含尿素的PBS平衡過夜。收集透析液,SDS-PAGE鑒定。

1.6細菌肽聚糖的提取與酶譜分析 參照Zeiger[5]報道的方法并加以改良,具體按以下步驟進行。

溶壁微球菌接種LB培養基后,37℃培養過夜。收集細菌后,重懸于20 ml冰預冷的25 mmol/L磷酸鹽緩沖液中。將菌液逐滴加入煮沸的8%SDS溶液中,煮沸1小時,1 000 r/min 15℃離心30分鐘收集后沉淀,再重復煮沸一次。用磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀重復5次后,再利用超速離心機4 000 r/min 25℃離心30分鐘后,收集后乙醚脫脂后,干燥獲得肽聚糖。

酶譜分析,即將收集的肽聚糖作為底物,摻入12%的分離膠中,進行SDS-PAGE電泳[6]。電泳后,采用復性緩沖液(20 mmol/L sodium phosphate buffer[pH7.0],0.1%Triton X-100和10 mmol/L MgCl2),37℃孵育48小時。采用1%的亞甲基藍染色后,雙蒸水脫色。實驗過程,設立溶菌酶和牛白蛋白分別為陽性和陰性對照。

1.7濁度實驗 將熱致死后的溶壁微球菌,重懸于不同pH值的磷酸鹽緩沖液(pH5.0～7.0)中,調整到其濁度在OD600為1.0。分別加入5μg/ml的重組蛋白后,37℃孵育,監測其濁度值的變化速率,計算ΔA·min-1mg-1(protein)值代表酶活性的大小[7,8]。

1.8統計學處理 每組樣本測定重復3次。所有檢測值均以±s表示。組間差異的比較采用兩樣本間 t檢驗,P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結果

2.1幽門螺桿菌cag4蛋白與其他溶菌轉移酶的氨基酸序列同源性分析 從NCBI數據庫,檢索獲得不同細菌分泌系統中溶菌糖基轉移酶的基因序列。再根據PFAM數據庫,搜索分析這些溶菌糖基轉移酶的催化保守區域,再采用clustalX 1.8將這些催化區域進行多重序列比較分析后,利用GenDoc軟件顯示結果。結果顯示,序列之間具有一定的保守性。其中,幽門螺桿菌 cag4蛋白中第 56位氨基酸(G LU56),被推測認為是發揮溶菌糖基轉移酶的催化活性的活性中心。

2.2原核表達載體pET-28a-cag4的構建 PCR結果顯示在510 bp左右有一條帶,與預計大小一致,無非特異性條帶。將PCR產物與pGEM-T載體連接產物轉化至DH5α,隨機挑取菌落,抽提質粒,雙酶切產物電泳后,陽性克隆出現的兩條帶分別位于約3 003 bp和510 bp處(見圖1)。

質粒pET-28a和TA克隆鑒定陽性的質粒分別經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后,回收酶切片段,16℃連接過夜,連接產物轉化至 E.coliBL21,隨機挑取菌落,抽提質粒,雙酶切產物電泳后,陽性克隆出現的兩條帶分別位于5.3 kb和510 bp處(見圖2)。

2.3幽門螺桿菌cag4蛋白重組蛋白的表達與純化

圖1 pGEM-T-cag4質粒雙酶切鑒定圖Fig.1 Double restriction enzyme digestion map of the recombinant plasmid pGEM-T-cag4

圖2 pET-28a-cag4質粒酶切鑒定圖Fig.2 Double restriction enzyme digestion map of the recombinant plasmid pET-28a-cag4

圖3 SDS-PAGE和Western blot鑒定結果圖Fig 3 The result of SDS-PAGEand Western blot

原核表達載體pET-28a-cag4轉化至 E.coliBL21中獲得重組工程菌,接種LB液體培養基,于37℃培養至OD600達到0.6時,加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導4小時,收集菌體進行SDS-PAGE檢測,可見在約Mr23kD處出現1條新的蛋白帶(見圖3),與理論預測值基本相符。空載體轉化菌pET-28a/BL21誘導后和未誘導重組工程菌在同一位置未出現相應的蛋白帶。將誘導后的全菌進行SDS-PAGE分離后電轉移至NC膜上,依次加入一抗體和二抗,DAB顯色后在相對分子量為23 000的新生蛋白帶處,有一特異性條帶,同時以空載體菌為對照,未發現條帶,說明該蛋白帶為目的蛋白,見圖3。育處理。結果如圖4可見,加入溶菌酶和重組蛋白幽門螺桿菌cag4蛋白的泳道2、3,都有明顯的溶解痕跡,而蛋白的泳道1未見。其中,溶菌酶的分子量大小約為14.4 kD,而幽門螺桿菌cag4蛋白約為23 kD。結果說明幽門螺桿菌NTCT11637 cag4蛋白具有溶菌糖基轉移酶活性。

圖4 酶譜分析結果圖Fig.4 The zymogram analysis of cag pathogenicity island protein 4

圖5 重組cag4在不同pH條件下的酶活性大小Fig.5 The enzyme activity of recombinant cag pathogenicity island protein 4 at different pHvalues

2.5不同pH條件下的酶活性變化 將溶壁微球菌重懸于不同pH值的磷酸鹽緩沖液(5.0,6.0,7.0)中,調整OD600為1.0,分別加入濃度為5μg/ml的重組 CAG4蛋白,37℃作用,間隔 15分鐘測定OD600,連續測定2小時,每次重復測定3次。結果如圖5所示,發現pH6.0組的OD600下降速率,較其他組呈現顯著性差異(P＜0.05)。說明幽門螺桿菌NTCT11637 cag4蛋白在偏酸性環境(pH6.0)下,其酶活性較強。采用ΔA·min-1mg-1值計算不同pH組酶活性大小,每次結果重復測定3次,計算均值和標準差,結果以±s表示;組間差異采用兩樣本t檢驗,結果表明P＜0.05,呈顯著性差異,如圖所示,pH6.0時的該酶活性較強。

3 討論

收集菌體溶解于裂解液中,冰上30分鐘后,超聲破碎,10 000×g離心收集上清和沉淀,沉淀溶解于裂解液中,SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的溶解度,發現目的蛋白主要存在于沉淀中,即以包涵體形式存在表達,故采用變性條件下純化蛋白。純化后,采用SDS-PAGE電泳鑒定表明,蛋白純度達98%以上,見圖4。純化后蛋白,進一步采用透析法進行蛋白的復性處理。

2.4重組蛋白酶活性的鑒定 復性處理后的蛋白,加入摻入溶壁微球菌為底物的聚丙烯酰氨凝膠中,100 V 2小時電泳分離后,進行復性處理和37°C孵

H.pylori感染在世界范圍內流行,現已證實感染H.pylori者,特別是 Ⅰ型H.pylori(含 Cag-PAI),可以導致慢性胃炎、消化性潰瘍,甚至胃癌和粘膜相關性淋巴瘤(MALT)的發生[3]。現已證明,CagPAI是編碼一個IV型樣分泌系統(type IV like secretion system)轉運CagA蛋白進入宿主細胞,發揮毒性作用,導致一系列的病理變化[3]。雖然目前對該結構的研究取得了一定的進展,但仍有許多問題尚未闡明,如其裝配形成機制,底物蛋白識別機制等等。然而,細菌的肽聚糖層作為天然的屏障,給該多蛋白復合物的組裝形成,造成了很大的困難。因此,分泌系統中發揮溶菌功能的組分,如VirB1、ORF169等,在多蛋白復合物裝配形成過程中起重要的作用。然而,這些溶菌糖基轉移酶在氨基酸序列上存在著很大的差異,可能僅僅是部分序列發揮水解肽聚糖功能,如根瘤農桿菌VirB/D轉運系統中VirB1[9]。因此,我們將不同細菌分泌系統中的溶菌糖基轉移酶,利用PFAM數據庫檢索獲得其發揮酶活性的保守功能域,進行多重序列之間的比對研究。結果表明cag4基因和其他細菌分泌系統中溶菌糖基轉移酶具有高度的同源性。其中,在α-螺旋結構的末端存在一個保守的谷氨酸(G lu),可以形成一個催化的活性中心,發揮催化活性作用。結合Slt35的三維晶體結構研究表明,在溶菌糖基轉移酶的氨基酸序列中還存在一個保守的AVG AY基序,可能是與肽聚糖結合作用的功能域[10](圖1)。

臨床上H.pylori感染常采用根除治療,但根除之后可以導致體內的菌群比例失衡,易產生新的胃腸道疾病。因此,根除療法勢必不是理想的治療手段。另一方面,隨著對克拉霉素和甲硝唑等抗生素的原發耐藥率普遍上升,也對這種治療方案提出了新的挑戰。尋找和研制新型抗生素或是抗菌藥物迫在眉睫。溶菌糖基轉移酶是細菌分泌毒性蛋白關鍵酶之一,具有良好的保守性,是新型抗生素良好的候選作用靶位。此次利用原核表達技術,重組獲得了大量具有酶活性的幽門螺桿菌cag4蛋白,為其結構與功能的研究和生物抑制劑的研發奠定了堅實基礎。

溶菌糖基轉移酶,與溶菌酶不同的是能在N-乙酰胞壁酸酯MurNAc內部形成了1,6糖苷鍵。而國外學者通過對其水解產物進行HPLC-MS質譜分析發現,其主要的水解產物是胞壁肽、四肽(Muropeptide G lcNAc-(1,6 anhydro) MurNAc-tetrapeptide)等[11,12]。而這些水解產物,可以被胞內受體Nod1識別,活化初始免疫應答,導致炎癥因子釋放[13,14]。因此,我們可以推測：H.pylori在感染過程中,幽門螺桿菌cag4蛋白不僅僅水解肽聚糖,促進分泌系統的裝配而發揮致病作用,還可以利用其水解產物,誘導炎癥反應。此外,在分泌系統裝配過程中,溶菌糖基轉移酶,水解肽聚糖釋放蛋白質進入周漿間隙,組裝形成分泌裝置。但這種作用釋放勢必要得到及時的終止,才能避免多蛋白的聚集,而影響其裝配形成效率。那么,細菌又是如何控制其表達,或是分泌其他抑制劑來終止這種反應呢?這些問題都值得進一步深入研究。

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