黃芪組分對乳鼠肥大心肌細胞ATP含量的影響＊

蘇敬澤，林 謙，農一兵

(1.北京市宣武區中醫醫院，北京 100050;2.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078)

循環血中和/或心肌局部血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是引起心肌細胞肥大的最重要活性物質[1～3]，而能量代謝障礙是心肌肥厚和充血性心力衰竭重要的推動因素之一，貫穿在心肌肥厚發生、發展的全過程中，是導致心肌肥厚發展為心衰的重要因素[4]。既往研究表明，黃芪對心衰、缺血缺氧、再灌注損傷和病毒損傷的心肌，具有保護心肌線粒體結構、提高生物氧化相關的多種酶的活性、減少乳酸脫氫酶外漏等作用，從而改善心肌能量代謝[5～7]。我們在血管緊張素Ⅱ致乳鼠心肌細胞肥大模型基礎上，選用黃芪注射液(主要成分為黃芪皂苷)和注射用黃芪多糖，觀察其對心肌細胞ATP含量的影響，旨在探討黃芪組分對心肌細胞能量代謝的干預作用，為中藥防治心衰提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物與主要試劑

Wistar大鼠由中國醫學科學院實驗動物中心提供;血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)，Sigma Inc;絡沙坦(losartan)，Merck Research Laboratories;黃芪注射液，成都地奧九泓制藥廠，10ml/支(批號0410027);注射用黃芪多糖，美國泛華醫藥公司，250mg/支(批號8k01101);Trypsin，SigmaInc;CollagenaseⅡ，GibcoInc;Dulbecco’sModified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham，Sigma Inc;胎牛血清(特級)，杭州四季青生物工程材料有限公司;5-Bromo-2’-Deoxyuridind(Brd-u)，Sigma Inc;小鼠α－橫紋肌動蛋白單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司;RNAgents Total RNA Isolation system，Promega;Access Quick RT-PCR System，Promega。

1.2 儀器

P4000高效液相色譜儀，UV6000二級管陣列檢測器，ChromQuest分析軟件，美國TSP公司Olympus IX71+制冷攝像頭倒置熒光顯微鏡;SHEL-LAB 2323 CO2培養箱;再鑫CLASS 100超凈臺。

2 方法

2.1 心肌細胞培養與鑒定

利用乳大鼠培養心肌細胞的方法最早由Harary報道[8]，本實驗以Harary的方法為基礎，同時參考其他研究者的經驗，將出生1d～3d的Wistar大鼠(雌雄不拘)在無菌條件下取出心臟，將心臟剪成1mm3大小的組織塊，胰酶、膠原酶混合消化液，于37℃水浴振蕩分次消化，直至組織塊完全消化。收集除第1次以外的細胞懸液，加入胎牛血清終止酶消化。4℃離心棄上清，制成單細胞懸液。然后按差速貼壁分離法孵育1h～1.5h，純化心肌細胞并計數，依需要密度接種。其中細胞培養液中含有10%胎牛血清、0.1mmol/L的Brd-u及青霉素100 mg/L、鏈霉素100萬U/L。細胞于37℃、5%CO2、95%濕度環境培養，大約每36h～48h換1次液，培養3d～4d后使用。

細胞培養第3天用免疫組織化學方法鑒定心肌細胞，一抗為小鼠α-橫紋肌動蛋白單克隆抗體，DAB顯色，本抗體對α骨骼肌和α心肌的肌動蛋白具有特異性。

2.2 分組與給藥

正常培養3d后換1%血清培養基培養，其他條件不變，實驗共分6組:(1)正常對照組:不加任何藥物;(2)肥大模型組:10－7mol/L的血管緊張素Ⅱ;(3)絡沙坦組:10－7mol/L血管緊張素Ⅱ+10－6mol/L losartan;(4)黃芪皂苷組:10－7mol/L血管緊張素Ⅱ+10－2g/L黃芪注射液;(5)黃芪多糖組:10－7mol/L血管緊張素Ⅱ+10－2g/L黃芪多糖注射液;(6)黃芪皂苷合多糖組:10－7mol/L血管緊張素Ⅱ+10－2g/L黃芪注射液+10－2g/L黃芪多糖注射液.

黃芪注射液及黃芪多糖注射液濃度選擇根據既往實驗結果[9]，溶劑為DMEM/F12，工作液濃度為終濃度的100倍。

2.3 ATP含量測定(HPLC)

參照Enrique CHACON[10]及黨永明[11]的方法并適當改進。以25cm2培養瓶培養心肌細胞，每瓶細胞數約3×106個，正常培養3d～4d后分組實驗。按24 h、48 h 2個時點加藥，每組每個時點重復做3瓶，求其平均值。

2.3.1 樣品制備 冰冷的D-Hanks沖洗細胞2次，棄去平衡液，稱培養瓶重量;每瓶加入1ml10%冰冷的高氯酸，將細胞刮入EP管中，立即置于液氮中保存，再次稱培養瓶重量，計算重量差值;測定時取出，用超聲波細胞破碎儀將細胞膜打碎;4℃10000rpm離心30min，取上清液;加入與2.5mol/L KOH，調PH至6.5，再次4℃10000rpm離心30min;取上清液用0.22μm濾膜過濾即成測定樣品。

2.3.2 色譜條件 色譜柱:ODS HYPERSIL C18分析柱(5μm，250mm×4.6mm);柱溫:室溫25℃;流動相:50mmol/L磷酸鉀緩沖液(含0.2%甲醇，pH 6.5)。實驗當天用微孔濾膜(0.2μm)抽濾、超聲脫氣，流速1 ml/min;紫外檢測波長254nm;樣品進樣體積20μl;實驗采用外標法定量。

2.3.3 結果判定 樣品出峰的保留時間與標準品比較，確定ATP成分并制定標準曲線。根據曲線峰面積及細胞質量計算各組心肌細胞ATP的含量。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 心肌細胞形態及鑒別結果

心肌細胞在培養24h開始伸展，細胞形態不規則，部分細胞聚集成團生長，開始出現收縮運動，3d后細胞有節律的收縮運動，成簇細胞尤為顯著。細胞免疫化學證實，99%以上的細胞為陽性染色細胞，只有極個別細胞不著色。證實原代培養的細胞純度很高，因此用該細胞進行的試驗是可靠的。

3.2 黃芪組分對肥大心肌細胞ATP含量的影響

3.2.1 ATP的定性分離 樣品出峰的保留時間與標準品相近(圖1、2)，心肌細胞樣品中加入標準品后出峰增高(圖3)，由此可以確定心肌細胞色譜圖中ATP的成分。

3.2.2 標準曲線 在選定的分析條件下，按外標定量法，ATP質量濃度為0.25～50.54ug·ml－1，濃度與峰面積有良好的線性關系，回歸方程、相關系數為Y=14361X+31357，R2=0.9995(n=8)。

圖1 正常樣品

圖2 標準品

圖3 樣品+標準品

3.2.3 精密度 日內和日間精密度實驗均含低、中、高3種濃度，日內實驗各濃度在1d內分別進樣5次，日間實驗各濃度每天進樣1次，連續觀測5d。結果表明，日內和日間均可獲得較好的重復性，二者相對偏差(RSD)分別在0.4%和2.1%以下。

3.2.4 回收率 在已知濃度的樣品中，分別加入低、中、高3種不同濃度的ATP標準品，按樣品測試方法測定其加樣回收，測得回收率為87.2%～118.5%(n=3)。

3.2.5 黃芪組分對肥大心肌細胞ATP含量的影響 表1顯示，24h各組心肌細胞ATP含量無顯著性差異;48h模型組ATP含量增加，與正常組比較差異顯著;絡沙坦組、黃芪皂苷、黃芪多糖及黃芪皂苷多糖組ATP含量也有所增加，其中絡沙坦組、黃芪皂苷及黃芪皂苷多糖組與正常組比較差異顯著，但各組ATP含量均低于模型組，差異顯著。

表1 黃芪組分對肥大心肌細胞ATP含量的影響

表1 黃芪組分對肥大心肌細胞ATP含量的影響

注:1)與模型組比較:P＜0.05;2)與正常組比較:P＜0.05

組別藥物終濃度(g/L)ATP含量(ug/g)24h 48h正常對照組 — 48.890±1.506 48.890±1.5061)模 型 組 — 50.250±0.574 64.917±0.7262)洛 沙 坦 組 10－6 49.980±0.986 60.313±0.7721)2)黃芪皂苷組 10－2 48.637±0.117 59.653±0.5901)2)黃芪多糖組 10－2 49.867±0.630 50.113±0.1991)皂苷+多糖組 10－2 49.277±0.609 59.900±0.6361)2)

4 討論

4.1 ATP是心肌收縮的直接供能物質

心肌代謝能量的來源主要是ATP等高能磷酸鍵，而線粒體是氧化代謝產生能量的主要細胞器官，它的主要功能是生產、儲存ATP。呼吸鏈及氧化磷酸化的酶類均集合于線粒體內膜上，呼吸鏈的主要成分還原型煙酰胺二核苷酸(NADH)脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、鐵硫蛋白、細胞色素b、c1、c、a、a3等在傳遞電子的同時，會使線粒體內膜形成質子(H+)跨膜電化學電位差，線粒體合成酶F1－F0復合體就可借此電位差進行ADP磷酸化生成ATP，使ADP磷酸化生成ATP是線粒體最重要的功能之一。線粒體合成酶F1－F0復合體即H+_ATP酶體系的生理功能在于利用膜內電子傳遞所產生的質子電化學能而合成ATP，其主要由兩部分組成，球狀的頭部與柄是亞單位F1，埋于內膜內的底部則為亞單位F0。F1亞單位由α、β、γ、δ、ε5種多肽鏈組成。β肽是具有催化活性的部位，γ肽可能是控制質子通過的閘門。實際上，F1亞單位是Ca2+，Mg2+-ATP酶復合物，具有ADP和ATP結合部位，經常有ADP和ATP牢固地結合在其上。一個結合位點上結合的ATP被移向胞質，另一個結合位點的ADP即被磷酸化形成新的ATP，重新占據ATP結合位點。

4.2 心肌肥厚時心肌組織ATP含量下降

心肌肥厚時，心臟不僅收縮、舒張功能異常，心肌細胞的收縮(耗能)結構、產能結構均發生改變，且心肌微循環功能受損，因此肥厚心肌的能量代謝必然受到影響。在靜息狀態下，肥厚心肌ATP含量下降42%，PCr下降58%，總肌酸含量降低24%，PCr/ATP比值降低32%，ADP升高85%。肥厚心肌ATP和肌苷含量減少的原因及具體機制尚不清楚，可能與下列因素有關，包括腺苷酸前體的減少，心肌細胞膜損傷致攝取能力降低，線粒體/肌原纖維比值和毛細血管與線粒體之間的彌散距離的變化等，尤其可能與心肌細胞本身產能機制的改變有關，即肥厚心肌糖酵解活性升高，心肌細胞更多地選擇葡萄糖而不是游離脂肪酸作為氧化供能底物。在底物可獲得量減少的情況下，使ATP產量減少。

4.3 黃芪組分配伍對肥大心肌細胞ATP含量的影響

黃芪是1味傳統的補氣藥，現代藥理研究證明，黃芪含有皂苷、多糖、黃酮和微量元素等多種成分，具有多方面的藥理作用[13]。特別是具有明顯的心血管作用[14]，可以改善心臟的收縮及舒張功能[15]，臨床常用于治療心力衰竭。本實驗發現，AngⅡ作用于心肌細胞24h，ATP含量無變化，48h引起ATP含量增加。黃芪皂苷或黃芪多糖或黃芪皂苷加多糖作用于AngⅡ致乳鼠肥大心肌細胞后48h，ATP含量高于正常組，但低于模型組，這是黃芪干預作用的結果，說明黃芪組分及組分配伍可在分子水平上抑制AngⅡ對心肌細胞能量代謝的影響，提示黃芪組分可能是通過對肥大心肌細胞能量代謝的干預作用預防心衰的發生發展，這就為黃芪防治心力衰竭提供了客觀的實驗依據。

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