息風定顫湯對帕金森病模型大鼠多巴胺能神經(jīng)元保護作用的研究＊

羅恩麗，鮑春齡，王德生

(1.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣州 510120;2.廣州中醫(yī)藥大學博士后科研流動站，廣州 510006;3.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437;4.哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，哈爾濱 150001)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見于中老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變性疾病，其患病率隨年齡的增加而遞增，隨著社會人口老齡化現(xiàn)象的日趨加劇，成為嚴重影響人類健康的疾病之一[1]。目前本病尚無滿意治療方法，如何對PD患者進行積極有效而安全的治療是一項亟待解決的問題。近年來，通過我們的臨床觀察發(fā)現(xiàn)以補腎活血息風為基本治療原則的息風定顫湯不但能緩解PD臨床癥狀、延緩疾病進展，而且毒副作用較小，為對其作用機制等進行深入研究，故進行本實驗，觀察息風定顫湯對PD模型大鼠行為學的影響，并探討其作用機制，以期為息風定顫湯臨床治療PD奠定理論與實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康Wister大鼠200只，雌雄不拘，體重250g±20g，8～10周齡，由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供，許可證號SCXK(黑)20020001。

1.1.2 藥品 將熟地、枸杞、珍珠母、天麻、肉蓯蓉、膽南星、全蝎等按6∶6∶5∶4∶3∶3∶1的比例稱量后由黑龍江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)院制劑室水煎醇沉，制成200%水溶液，0.1mPa滅菌15min 4℃保存?zhèn)溆谩⑷?味不適合水煎的藥物經(jīng)去雜質(zhì)、烘干等處理后粉碎達100～120目，于治療時按比例混入上述溶液中，充分搖勻灌服。以上所有中藥飲片均購自哈藥集團人民同泰藥店。美多巴由上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)，每片含200mg左旋多巴、50mg芐絲肼，批號SH0312。

1.1.3 試劑及主要儀器 6-羥基多巴胺(6-OHDA)、阿樸嗎啡(APO)、多巴胺(DA)標準品、3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-羥色胺(5-HT)及5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)均購自Sigma公司，酪氨酸羥化酶(TH)單抗購自Chemicon公司。

Narishinge ST-85-28型腦立體定位儀，日本Kasuya公司;HP1100型高效液相色譜系統(tǒng)檢測器，Aglient U.S.A;LC-10AD液相恒流泵，SHIMADZU，U.S.A;L-ECD-6A電化學檢測器，Aglient U.S.A;7125高壓六通進樣閥，RHEODYNE，U.S.A;ODSC18色譜柱(10μm，250×4.6mm)，美國迪馬公司;Olympus光學顯微鏡，日本Olympus公司;尼康DXM1200F數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)，日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 制備PD模型大鼠 取180只Wistar大鼠，以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，顱平位固定于腦立體定位儀上，參照Paxinos等[2]大鼠腦立體定位圖譜，采用紋狀體兩點注射法制備PD模型大鼠，選左側(cè)紋狀體注射坐標點為:(1)前囟前1.0mm，向左旁開3.0mm，前后囟水平以下4.5mm;(2)前囟后1.0mm，向左旁開4.0mm，前后囟水平以下6.0mm。鉆顱后，取5μl微量進樣器緩慢垂直進針達相應坐標點，分別注入15μg/5μL新鮮配制的6-OHDA(溶于5μl含0.2%抗壞血酸的生理鹽水中)，注射速度為1.0μl/min，注射完畢后留針10min，然后以1mm/min的速度退針，縫合皮膚，清醒后放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。另取20只大鼠為假手術組，同上法于左側(cè)紋狀體區(qū)兩點各注射含0.2%的抗壞血酸生理鹽水5μl。

1.2.2 行為學測試及分組 分組:分別于術后3～6周對各組大鼠進行行為學檢測:給予背部皮下注射APO 0.5mg/kg(溶于無菌注射用水中)，誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。每次在注射APO 10min后即開始記錄，共記錄30min，如大鼠恒定轉(zhuǎn)向右側(cè)，且平均轉(zhuǎn)速≥7r/min，視為模型制備成功。

本實驗共制備模型成功鼠99只，隨機分為5組:美多巴組、中藥高、中、低劑量組各20只，模型組19只，另取左側(cè)紋狀體注射生理鹽水20只大鼠作為假手術組。分別給予美多巴(將美多巴研末加入蒸餾水配成9%的懸濁液)67.5mg/(kg·d)、息風定顫湯15g/(kg·d)、7.5g/(kg·d)、3.75g/(kg·d)，蒸餾水10ml/(kg·d)、蒸餾水10ml/(kg·d)灌胃治療，每日1次，連續(xù)4周。

1.2.3 行為學測試 分別于灌胃前、灌胃2周、灌胃4周后將各組大鼠皮下注射APO 0.5mg/kg誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，記錄給藥后10min～40min內(nèi)各組大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，比較各組大鼠治療前后大鼠旋轉(zhuǎn)行為的改變。

1.2.4 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定 在行為學檢測完畢后，取模型組大鼠9只，其余組各取10只，立即斷頭取腦，干冰上迅速分離出雙側(cè)紋狀體并稱重、標記，置液氮中速凍后貯存于－70℃的超低溫冰箱內(nèi)待測。測定前，將冰凍組織室溫融化，加入冰冷的0.4mmol/L高氯酸溶液(100mg組織加入1000μl高氯酸溶液)勻漿，高速離心(12000rpm 20min 4℃)，取上清液50μl進樣，應用高效液相色譜電化學檢測器(HPLC-ECD)測定單胺遞質(zhì)的含量。

色譜條件:色譜柱:DiamonsilTMC18200×4.6mm，內(nèi)徑5μm;流動相:85mmol/L乙酸鈉，100mmol/L檸檬酸，0.9mmol/L辛烷磺酸鈉，0.2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，甲醇(85∶15，V/V);電化學檢測器的工作電極為玻璃碳，參比電極為固態(tài)的Ag/AgCl;檢測電壓為+0.7 V;流速為1.0ml/min;柱溫30℃。各種待測物質(zhì)均得到良好分離。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的計算:采用峰面積法對待測物質(zhì)定量。

1.2.5 TH免疫組化檢測 末次行為學測試后，每組各取10只大鼠，麻醉后灌注、固定，制作中腦(在灰白結(jié)節(jié)后緣向腦干方向作冠狀切面)病理組織片，用ABC法進行TH免疫組化檢測。

1.2.6 TH圖像分析和統(tǒng)計方法 采用尼康(Nikon)DXM1200F數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)對切片進行圖像分析，每例TH免疫組化切片為緊鄰的3張切片，每張片子取中腦腹側(cè)被蓋區(qū)和黑質(zhì)致密區(qū)各2個視野，測錄窗為90588.11mm2。

2 結(jié)果

2.1 模型制備情況

該實驗模型成功率為55%，模型成功的大鼠平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為10.44±4.73r/min。標準的PD模型大鼠于6-OHDA損毀術后3～4周，即表現(xiàn)出輕微的向健側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，同時四肢肌張力稍增高，以前肢明顯，伴見步態(tài)不穩(wěn)及輕微震顫。3～6周后，背部皮下注射APO后即出現(xiàn)尾僵直、震顫、好斗、對外界刺激敏感、易于激惹及步態(tài)不穩(wěn)等，0.5min～5min后動物表現(xiàn)為向健側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，旋轉(zhuǎn)時身體側(cè)曲成環(huán)狀，頭尾相接，在原地以健側(cè)下肢為支點向健側(cè)單一方向旋轉(zhuǎn)，同時伴見向健側(cè)的嗅探、覓食、咬、舔等動作。旋轉(zhuǎn)行為在給藥后15min～30min內(nèi)最為迅速，30min后旋轉(zhuǎn)明顯變慢，50min～60min時旋轉(zhuǎn)基本停止。

2.2 息風定顫湯對PD模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響

表1 各組大鼠治療前后平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的變化

表1 各組大鼠治療前后平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的變化

注:與灌胃前比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 假手術組 模型組 美多巴組 中藥高劑量組 中藥中劑量組 中藥低劑量組灌 胃 前 0 10.48±6.41 10.42±5.25 10.47±4.11 10.43±3.82 10.47±3.69灌胃后2周 0 10.48±5.61 7.41±3.80＊△ 8.82±4.35 7.86±3.14＊△ 8.57±3.79灌胃后4周 0 10.54±6.46 8.14±4.49 7.39±4.24＊△ 4.92±2.54＊＊△△ 7.51±3.64＊△

可見，隨著治療時間的延長，中藥高、中、低劑量組大鼠的行為學改變明顯好轉(zhuǎn)，以中藥中劑量組改善最明顯。同時可見，3組大鼠皮下注射APO后所出現(xiàn)的尾僵直、震顫、四肢肌張力增高及步態(tài)不穩(wěn)等也有明顯改善，較治療前安靜、不易激惹。而美多巴組大鼠在給藥后2周有1/3大鼠在灌服美多巴30min后出現(xiàn)對側(cè)自發(fā)旋轉(zhuǎn)行為，有1/2大鼠出現(xiàn)灌服美多巴30min后萎靡不振、僵住不動、刻板動作(損毀側(cè)上肢節(jié)律性不自主拍擊動;頭頸、軀干向?qū)?cè)側(cè)彎和扭轉(zhuǎn);不自主咀嚼、舔食作)等表現(xiàn)，且灌胃4周后，平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)不較2周減少。這可能與美多巴的神經(jīng)毒性有關。

表2 各組大鼠紋狀體單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測定的比較

表2 各組大鼠紋狀體單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測定的比較

注:與本組損毀對側(cè)比較:※P＜0.05，※※P＜0.01;與假手術組損毀側(cè)比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組損毀側(cè)比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

假手術組 模型組 美多巴組 高劑量組 中劑量組 低劑量組DA 損毀對側(cè) 10.85±3.15 11.80±0.98 11.72±1.99 10.69±2.60 11.10±4.33 11.20±3.23損 毀 側(cè) 11.68±1.91▲▲ 0.22±0.14※※△△ 5.96±3.11※△▲ 3.44±2.87※※△△ 8.68±5.51▲▲ 4.82±2.42※△▲HVA 損毀對側(cè) 0.22±0.10 0.18±0.04 0.17±0.07 0.14±0.05 0.17±0.08 0.18±0.06損 毀 側(cè) 0.24±0.07▲ 0.08±0.03※※△ 0.07±0.03※△ 0.06±0.02※※△△ 0.13±0.08 0.08±0.04※△DOPAC 損毀對側(cè) 0.25±0.13 0.28±0.06 0.26±0.08 0.27±0.11 0.22±0.13 0.27±0.15損 毀 側(cè) 0.15±0.02▲▲ 0.02±0.01※※△△ 0.13±0.09※▲ 0.10±0.06※ 0.21±0.13▲▲ 0.09±0.04※△5-HT 損毀對側(cè) 0.34±0.20 0.28±0.19 0.36±0.07 0.33±0.12 0.26±0.15 0.28±0.17損 毀 側(cè) 0.31±0.11 0.29±0.09 0.33±0.11 0.36±0.20 0.34±0.13 0.30±0.08 5-HIAA 損毀對側(cè) 0.20±0.11 0.14±0.05 0.16±0.05 0.15±0.03 0.10±0.06 0.13±0.06損 毀 側(cè) 0.13±0.02 0.12±0.03 0.16±0.05 0.18±0.04▲ 0.16±0.06△0.13±0.03

圖1 各組大鼠中腦被蓋部TH免疫組化染色比較(400×)

2.2 紋狀體單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的檢測結(jié)果

可見，美多巴、中藥高、中、低劑量均能增加PD模型大鼠紋狀體DA及HVA、DOPAC含量，其中中藥中劑量組增加最顯著，而5-HT、5-HIAA在上述幾組大鼠損毀對側(cè)、損毀側(cè)沒有明顯的差異。

2.3 TH免疫組化檢測結(jié)果

光鏡觀察可見，TH陽性細胞形態(tài)為多角形或椎形細胞，胞漿被染成棕褐色，主要分布于中腦腹側(cè)被蓋部和黑質(zhì)致密部、網(wǎng)狀部。由于每只大鼠中腦切片所取的部位很難完全一致，故我們采用每只大鼠損毀側(cè)和損毀對側(cè)的TH陽性細胞數(shù)的比值進行比較(結(jié)果見表3圖1)。

實驗結(jié)果可見，美多巴、中藥高劑量、中藥中劑量和中藥低劑量均能明顯增加PD模型大鼠TH的表達，但以中藥中劑量最明顯，其次是美多巴及中藥高劑量，最后是中藥低劑量。

表3 各組大鼠中腦TH免疫組化檢測結(jié)果

表3 各組大鼠中腦TH免疫組化檢測結(jié)果

注:與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與假手術組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 損毀側(cè)(個) 損毀對側(cè)(個) 損毀側(cè)/損毀對側(cè)(%)假手術組 251.80 ±9.39＊＊ 269.2 ±10.23 95.13±22.77＊＊模 型 組 41.01 ±18.88△△ 231.29±21.42△△ 17.92±8.69△△美多巴組 180.78±71.13△△＊＊ 243.20±25.57△ 73.43±26.34＊＊△高劑量組 166.48±19.48△△＊＊ 236.20±20.38△ 70.82±9.97＊＊△△中劑量組 224.16 ±19.85＊＊ 264.17±14.89＊＊ 85.01±7.83＊＊低劑量組 89.36 ±34.33△△* 227.43±22.59△△ 36.36±21.79*△△

3 討論

PD從臨床表現(xiàn)上看，大致相當于中國醫(yī)學之“掉”、“振掉”、“痙癥”、“拘攣”、“顫振”、“顫癥”等范疇。因本病以風氣內(nèi)動為病機要點，肝腎虧虛為主，兼以脾之氣血不足，痰瘀阻滯，故治當以補肝腎、活血化痰、息風止痙為主，少佐益氣養(yǎng)血之品。據(jù)此治則，臨床我們觀察發(fā)現(xiàn)，補腎活血息風化痰法在治療本病時不但能緩解臨床癥狀、延緩疾病進展，而且毒副作用較小。為了闡明中藥治療的作用機制，我們精選了十幾味藥物組成息風定顫湯進行動物實驗研究。方以熟地、山萸肉、枸杞等補益肝腎;天麻、鉤藤等平肝息風、定顫止痙;加之全蝎等蟲類藥搜風藥增強其息風止痙之功效，佐以化痰活血通絡;以三七等活血化瘀;并佐以黃芪、白芍等補益氣血陰陽之不足。全方以補肝腎、息風止痙、活血為主，佐以化痰、補益氣血，共奏息風定顫止痙之功效，使震顫、強直、少動等癥狀緩解。

PD大鼠藥物誘導的旋轉(zhuǎn)行為學改變，與中腦、紋狀體DA以及TH的減少程度密切相關，可直接反映黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元變性壞死程度。由于迄今尚無有效的非侵襲性生理學方法檢測PD大鼠中腦DA能神經(jīng)系統(tǒng)的損毀程度，故檢測造模大鼠的旋轉(zhuǎn)行為已成為衡量模型制作成功與否、判定模型損傷程度及治療效果好壞的最常用手段[3、4]。本實驗中息風定顫湯高、中、低劑量組灌胃治療后旋轉(zhuǎn)行為均有所改善，并隨著治療時間的延長，行為學改變明顯好轉(zhuǎn)，且APO皮下注射后，所出現(xiàn)的尾僵直、震顫等均明顯好轉(zhuǎn)，治療后大鼠較前安靜、不易激惹。說明息風定顫湯是治療PD模型大鼠的有效藥物，并隨著時間的推移療效增加，以中劑量效果最好。這可能是由于灌胃治療后使DA的含量增加，緩解了模型動物損毀側(cè)紋狀體內(nèi)由于末梢退變而誘導的突觸后D2受體超敏和受體數(shù)目增多的現(xiàn)象。因此使用DA受體激動劑APO時，它所誘導產(chǎn)生的PD模型大鼠向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)行為也減少了。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(DA及其代謝產(chǎn)物)含量減少是PD的主要神經(jīng)生化改變，其減少的程度與黑質(zhì)細胞喪失的程度成正比，因此中腦黑質(zhì)紋狀體DA的含量測定是衡量治療PD有效與否的最客觀指標。本實驗采用高效液相色譜電化學法測定DA、HVA和DOPAC含量，發(fā)現(xiàn)中藥高、中、低劑量組大鼠損毀側(cè)紋狀體DA含量、HVA、DOPAC含量均有明顯增加，其中中劑量組增加最明顯，說明息風定顫湯能促進DA的釋放，顯著增加PD大鼠紋狀體DA及代謝產(chǎn)物含量，補充黑質(zhì)紋狀體DA的不足，提高DA能神經(jīng)元的活動，增強運動能力，從而改善PD模型大鼠的旋轉(zhuǎn)行為。這為中藥治療PD提供了有力的神經(jīng)化學依據(jù)。

TH是DA合成的限速酶，TH是DA合成的主要調(diào)節(jié)因素，是DA合成的限速酶，在PD的病理生理中發(fā)揮著重要作用。PD動物模型和患者體內(nèi)TH從基因表達到酶蛋白含量及酶的活性都有廣泛的異常改變【9】。實驗研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA損毀DA能神經(jīng)元嚴重程度與TH陽性的細胞被破壞的程度是密切相關的[5]。TH陽性細胞表達的多少不僅體現(xiàn)DA能神經(jīng)元被破壞的程度，同時可用來判定PD治療效果。本實驗結(jié)果顯示，中藥高、中、低劑量組TH的陽性細胞表達均較模型組顯著增加，說明息風定顫湯對6-OHDA誘導的PD模型大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元具有保護作用。

綜上所述，可見息風定顫湯可通過上調(diào)TH的表達，增加DA能神經(jīng)元DA的釋放，對多巴胺能神經(jīng)元具有保護作用改善PD模型大鼠的旋轉(zhuǎn)行為。說明息風定顫湯是治療PD模型大鼠的有效藥物，以中劑量療效最好，并揭示了其作用機制，從而為息風定顫湯臨床治療PD奠定了理論與實驗基礎。

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[3]Schwating RK，Huston JP.The unilateral 6-hydroxydoppamine lesion model in behavioral brain reseaech.Analysis of functional deficits，recovery and treatments[J].Prog Neurobiol，1996，50:275-331.

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