首烏延壽丹對家兔動脈粥樣硬化形成的防治作用及其可能機制

王桂敏，韓鳳麗

(1.遼寧醫學院附屬一院中醫科，遼寧 錦 州 121001;2.內蒙古莫旗人民醫院，內蒙古 呼 倫貝爾 162850)

首烏延壽丹出自清·陸九芝《世補齋醫書》，原名延壽丹，由何首烏、菟絲子、杜仲、女貞子、桑椹、黑芝麻、旱蓮草、金櫻子、生地黃、牛膝、豨薟草、桑葉、忍冬藤13味中藥組成。方中何首烏、菟絲子、杜仲、女貞子、旱蓮草、桑椹、黑芝麻、金櫻子、生地黃補腎益精;牛膝、桑葉、忍冬藤、豨薟草活血通脈。諸藥相合共奏補腎活血之功，是延緩衰老之名方。現代藥理學研究表明，本方能夠通過降脂、抗凝、改善血管內皮功能等作用抑制AS的發生發展[1]。為了驗證首烏延壽丹是否能通過其他途徑起到防治AS的作用，本實驗通過喂飼高脂飼料的方法，建立兔AS模型，應用首烏延壽丹進行干預治療，并觀察首烏延壽丹對AS血管PDGF-B、MMP-9表達的影響，以期為首烏延壽丹防治AS提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料

健康日本大耳白兔32只，均為雄性，體重2kg～2.5kg，由遼寧醫學院試驗動物中心提供。高脂飼料:1%膽固醇，8%熟豬油和91%的普通飼料。

1.2 藥物、試劑、儀器

1.2.1 藥物 首烏延壽丹由遼寧醫學院附屬第一院中藥局提供，按照原方藥物用量(何首烏50g，豨薟草、菟絲子各15g，杜仲、懷牛膝、女貞子、旱蓮草、桑葉、黑芝麻、桑葚子、金櫻子各10g，金銀花、生地各5g)，在藥學實驗室研成粉末，存放在干燥通風處備用。根據人體-家兔體表面積比值法換算家兔的每日用藥量[2]。辛伐他汀片(國藥準字H20065119)由山東羅欣藥業生產。

1.2.2 試劑及儀器 兔抗人MMP-9多克隆抗體(上海太陽生物有限公司)，兔抗鼠PDGF-B多克隆抗體(北京博奧森生物制劑有限公司)，CIAS-1000細胞圖像分析系統(北京大恒圖像視覺有限公司)，臺式高速冷凍離心機(太倉市醫療器械廠)。

1.3 分組與給藥[3]

日本大耳白兔單籠飼養，室溫20℃～22℃，相對濕度為50%～60%，經適應性喂養1周后開始試驗。遵循隨機原則，將動物分成4組，每組8只。A組(空白對照組)，繼續喂飼普通飼料140g/d/只，B組(模型組)喂飼高脂飼料140g/d;C組(首烏延壽丹組)喂飼高脂飼料140g/d加首烏延壽丹1g/kg.d;D組(辛伐他汀組)喂飼高脂飼料140g/d加辛伐他汀2.5mg/kg.d[4]，喂養至第12周末。

1.4 取材與指標測定

1.4.1 取材 第12周末(實驗結束時)，于清晨空腹從兔耳中動脈采集血液5ml，注入不含抗凝劑的普通試管，靜置后離心分離血清。用全自動生化儀測定總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、甘油三酯(TG)的水平。

實驗動物于第12周末采用頸動脈割傷法處死，迅速剖開腹腔分離腹主動脈，剝除外膜結締組織及脂肪，取約1cm長動脈血管沖凈，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于光鏡觀察病理形態學及免疫組化檢測。

1.4.2 指標測定 將兔主動脈標本于4%中性甲醛溶液固定24h之后，自來水沖洗4h～6h，逐級脫水、透明、浸蠟、包埋制成臘塊，用石蠟切片機進行連續切片厚度5μm，于45℃溫水中展片，分別用普通玻片和多聚賴氨酸防脫玻片，撈片后置于56℃溫箱中干燥約2h～3h，用于HE和免疫組化染色。每一標本取3張切片(普通玻片)作HE染色，每一標本取3張切片(防脫玻片)作免疫組化染色，均按試劑盒步驟進行操作。免疫組化以棕色反應物為陽性信號，細胞漿染色測定其平均灰度值。

1.5 統計學方法

SPSS 13.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，4組間比較采用單因素方差分析(ANVOA)，組間兩兩比較用LSD法進行顯著性檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。病理形態學資料采用對比描述分析。

2 結果

2.1 各組兔血脂變化

表1顯示，第12周時，與正常對照組相比，模型組、首烏延壽丹組、辛伐他汀組TG、TC、LDL-C水平均顯著升高(P＜0.01，P＜0.05)，HDL-C顯著降低(P＜0.01);與模型組相比，首烏延壽丹組、辛伐他汀組TG、TC、LDL-C明顯降低(P＜0.05)，HDL-C明顯升高(P＜0.01)，首烏延壽丹組與辛伐他汀組TG、TC、LDL-C、HDL-C差異無顯著性(P＞0.05)。

表1 各組兔血脂水平變化

表1 各組兔血脂水平變化

注:與正常組比較:*P＜0.05，△P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，#P＜0.01

組別 TC(mmol/L) TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L)正 常 對 照 組1.64±0.74 0.72±0.25 0.61±0.26 0.52±0.18模 型 組 26.7±4.83* 6.00±1.43* 13.17±2.68* 3.66±0.57△中 藥 組 11.24±2.32＊▲ 1.65±0.65△▲ 3.89±1.58＊▲ 6.65±0.72△#辛 伐 他 汀 11.79±2.14＊▲ 2.04±0.73＊▲ 4.02±1.62＊▲ 6.48±0.61△#

2.2 各組血管內膜病理形態學改變

HE染色顯示，正常對照組血管內膜光滑、連續，內皮細胞完整，排列整齊，內彈力膜清晰完好，中膜由平滑肌細胞(SMC)組成，排列整齊，外彈力膜完整;模型組血管內膜內皮細胞絕大多數缺失，內膜不均勻明顯增厚，內膜中含有大量的泡沫細胞，內有脂質沉積，內彈力膜消失，中膜SMC增殖，排列紊亂，外膜改變不明顯;首烏延壽丹組、辛伐他汀組內膜輕度增厚，泡沫細胞少量，內彈力膜尚清晰完整，中膜SMC排列尚整齊，外膜改變不明顯(見圖1)。

圖1 各組兔血管內膜形態學變化(HE×200)

2.3 各組兔血管組織PDGF-B、MMP-9蛋白表達的改變

表2顯示，PDGF-B表達于細胞的胞漿中，正常對照組血管表達量低，呈淺棕黃色;模型組表達明顯增多，與正常對照組比較差異有顯著性(P＜0.01);與模型組比較，首烏延壽丹組及辛伐他汀組表達明顯減輕(P＜0.01)，2用藥組PDGF-B表達無統計學差異。

表2 各組PDGF-B及MMP-9平均灰度值比較

表2 各組PDGF-B及MMP-9平均灰度值比較

注:與正常組比較:*P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.01

灰度值 正常組 模型組 中藥組 西藥組PDGF-B 21.34±6.66 145.41±13.28* 76.51±13.14＊▲ 73.03±10.58＊▲MMP-9 13.32±3.85 74.58± 6.78* 33.52±3.64＊▲ 32.72± 4.05＊▲

表2顯示，MMP-9表達于胞漿，棕色反應物。正常對照組血管壁表達少;模型組表達明顯增多，與正常對照組比較差異有顯著性(P＜0.01);與模型組比較，首烏延壽丹組及辛伐他汀組表達明顯減輕(P＜0.01)，2用藥組MMP-9表達無統計學差異。

3 討論

動脈粥樣硬化(AS)是以血管內皮細胞損傷，大量脂質沉積，炎性細胞浸潤，血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和遷移，細胞外基質成分增多和泡沫細胞出現，最后粥樣斑塊形成為其主要病理基礎的疾病，其中VSMC增殖、遷移是其關鍵性環節之一[5]。已知血小板源性生長因子(PDGF-B)是最有力的促有絲分裂源，可促進動脈中膜收縮型SMC轉化為分泌型SMC，并遷移到內膜下參與粥樣斑塊形成[6]，同時分泌大量的活性物質，促使細胞黏附及強烈的縮血管作用。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)能夠分解VSMC基底膜基質，將SMC從基底膜中釋放出來，從而引起VSMC的移行，在AS發生和發展過程中起著十分重要的作用[7]。

中醫學認為，AS的發生是以腎虛血瘀為其主要病理基礎的[8]。腎為元氣之根，內寓元陰元陽，若年老之人腎氣虧虛，無力推動血液運行而致血流遲緩;或腎陽虛衰，虛寒內生，血液凝滯;或腎陰不足，虛火灼液，血液濃縮，最終瘀血阻滯脈道。這種腎虛而致血瘀的過程與現代醫學所論述的動脈內膜先有內皮細胞損傷、凋亡，繼而脂質沉積，纖維組織增生，以致AS斑塊形成的過程極為相似，因此認為腎虛血瘀是AS形成的主要病理基礎。所以本文選擇補腎活血方首烏延壽丹作用于AS模型，觀察首烏延壽丹對AS血管PDGF-B、MMP-9表達的影響。

TC、TG和LDL-C是血漿中血脂的主要成分，HDL-C是AS的重要防御因子，有明顯抑制AS的發生發展和促進其消退的作用。本實驗研究表明，通過高脂飼料喂養12周后，所有高脂飼料喂養的日本大耳白兔血清TG、TC、LDL-C水平均較正常對照組升高，HDL-C水平降低，內膜增厚，提示AS形成過程中存在血脂代謝紊亂，其中以模型組最為嚴重;與模型組比較，首烏延壽丹能夠顯著降低TG、TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平，提示首烏延壽丹能夠通過改善血脂代謝紊亂并抑制AS形成。

PDGF是一種促細胞分裂劑，主要由血小板釋放。其中PDGF-B具有促進動脈中膜收縮型SMC轉化為合成型SMC，并向內膜下遷移的作用[9]，增殖的SMC可吞噬脂質形成泡沫細胞，從而加速AS的形成。

本實驗中觀察到，模型組PDGF-B蛋白表達較正常對照組顯著增多;與模型組比較，首烏延壽丹組PDGF-B蛋白表達明顯減輕，其效果與辛伐他汀相似，提示首烏延壽丹能降低PDGF-B蛋白水平，從而抑制SMC的增殖及轉型，進而抑制AS的形成。

MMP是降解細胞外基質的主要酶類，可為SMC從中膜遷移至內膜掃清道路[10]。其中MMP-9是MMP家族中的重要成員，主要功能是降解IV型膠原和彈力纖維，在基質降解、VSMC遷移、AS形成以及促進斑塊破裂上起重要作用[11]。本實驗表明，模型組MMP-9蛋白表達較正常對照組顯著增高;與模型組比較，首烏延壽丹組MMP-9蛋白表達明顯減輕，提示首烏延壽丹能降低MMP-9蛋白水平，從而抑制SMC從中膜向內膜遷移。此結果與以往研究的系統給予MMP-9抑制劑[12]，早期可減少VSMC向內膜遷移的結果相同。

綜上所述，首烏延壽丹能夠通過改善血脂代謝紊亂，抑制PDGF-B、MMP-9的表達、抑制內膜增生而起到防治AS的作用。其效果與HMG-CoA還原酶抑制劑辛伐他汀相同，表明首烏延壽丹抗AS療效可靠。本文從分子生物學水平探討了首烏延壽丹抗AS機制，為臨床應用首烏延壽丹防治AS提供了進一步的理論依據。

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