養心通脈有效部位方對梗死心肌細胞因子分泌、血管新生及動員MSCs歸巢的影響＊

李勇華，鄭景輝，袁肇凱△，王麗萍，簡維雄，黃獻平

(1.重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶 萬 州 404120;2.湖南中醫藥大學中醫診斷學國家重點學科，湖南 長 沙 410007)

近年來研究表明，通過骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)移植改善缺血心肌功能，重建梗死心肌喪失的心肌細胞以治療缺血性心臟病，顯示有良好的臨床應用前景，已成為國內外心血管疾病研究領域的熱點[1]。血管新生是心肌細胞再生和成活的前提和基礎，這也是MSCs發揮療效的關鍵途徑之一。尋找能有效促進外周血液中MSCs定向歸巢于損傷心肌并促進血管新生的藥物，是當前干細胞研究領域的焦點之一。養心通脈有效部位方(active principle region of Yangxing Tongmai Formula，apr-YTF)是由我國著名中醫學家秦伯未先生運用“扶養心氣，和通血脈”之法治療胸痹心痛的有效名方研制而成。本課題組已觀察到，臨床應用養心通脈片能很好地抗心絞痛[2]，應用養心通脈方6周后的心肌缺血大鼠左室缺血面積顯著低于血管生成素組，缺血邊緣區的血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的表達量和血管面密度較之病理模型組的3項指標均有明顯增加[3]。但apr-YTF是否具有調控血管生長因子而促進MSCs歸巢于受損心肌組織的作用，現作進一步研究并報道如下。

1 材料

1.1 動物

SD雄性大鼠，體重240g±20g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號SCXK(湘)2009-0004。

1.2 藥物與試劑

養心通脈有效部位方，由中南大學藥學院依本課題組穩定的制作工藝制作提供;重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)，齊魯制藥有限公司;香丹注射液(復方丹參注射液)，北京雙鶴高科天然藥物有限責任公司;CD34+、Ⅷ因子、VEGF、bFGF兔源性多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司;血管內皮生長因子受體(Flk-1)兔源性多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司;兔抗大鼠SP免疫組化染色試劑盒、DAB免疫組化顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 儀器

DW-3000小動物人工呼吸機，淮北正華生物儀器設備有限公司;數字彩色顯微圖像系統7001×UVI，英國UVI;Image-Pro Plus圖像分析系統，美國。

2 方法

2.1 造模

方法[4、5]，取健康清潔級雄性SD大鼠60只，適應性飼養觀察1周，以3%水合氯醛腹腔麻醉(10ml/kg)，背位固定，頸部去毛，剪開上皮，分離頸前肌暴露氣管，游離并用雙線穿過，提起雙線先用20號穿刺針尖刺破3～4氣管軟骨間，再以20號穿刺針頭(改為尖端圓鈍)經破口插入氣管，另端連于微型人工呼吸機行正壓呼吸(呼吸時比1∶1，呼吸頻率80次/min，潮氣量10ml/kg)，動脈夾將雙線在氣管穿破處固定，蓋PBS濕紗布，胸部去毛、消毒，離正中線約0.5cm處縱行切開皮膚約2cm，逐層分離肌肉，在第3～4肋間剪破肋間肌層。以自制小拉鉤拉開胸腔，輕壓右側胸廓暴露心臟，小心剪開心包膜，以3/8不銹鋼小圓針和6/0號絲線穿過肺動脈圓錐與左心耳交界稍下1mm～2mm處，結扎左冠狀動脈左前降支。結扎前后記錄Ⅱ導聯心電圖，以結扎部位以下心肌變蒼白、搏動減弱且出現J點明顯抬高為造模成功，逐層縫合胸壁，待動物恢復自主呼吸后停止人工呼吸，縫合氣管和頸部皮膚。

2.2 分組

取造模成功的大鼠32只，隨機分為4組，分別為apr-YTF組、香丹注射液組、rhG-CSF組、模型對照組，每組8只。

2.3 給藥方法

apt-YTF組按1.2g/(kg·d)劑量腹腔注射PBS稀釋的apr-YTF注射液，香丹注射液組按1.2g/(kg·d)劑量腹腔注射PBS稀釋的香丹注射液，rhGCSF組按10μg/(kg·d)劑量皮下注射PBS稀釋的rhG-CSF注射液，模型對照組腹腔注射與apt-YTF組等量的PBS，均于造模3h后給藥，連續5d。

2.4 檢測指標及方法

2.4.1 心肌瘢痕組織微小血管密度 同上處理的各大鼠心肌同部位切片，經masson’s三色染色，隨機選擇3個梗死區心肌瘢痕組織的高倍視野計算毛細血管數，取平均單個視野的微小血管數為微小血管密度。

2.4.2 心肌組織中CD34+細胞、Ⅷ因子、Flk-1、VEGF、bFGF的含量 分別處死各組大鼠，取出心臟甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，沿心臟長軸切3μm厚連續切片，分別按免疫組化試劑盒說明書的操作步驟進行CD34+細胞、Ⅷ因子、Flk-1、VEGF、bFGF的相關抗原抗體免疫組織化學染色，以細胞內出現棕黃顆粒沉著為陽性反應。4組切片標本的免疫組化染色均在同一時間、同一部位、相同條件下進行，用數字彩色顯微圖像系統隨機拍攝心肌梗死邊緣區6個高倍(×400)視野，以Image-Pro Plus圖像分析系統測定其指標陽性染色反應強度，用IOD值表示，IOD值=陽性反應面積/平均光密度(光密度與陽性強度呈反比)，取其均值以代表各指標蛋白表達的相對含量。

2.5 統計學方法

使用SPSS統計16.O軟件系統，所測數據以均值±標準差表示，多組間均數比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為有顯著性差異。方差不齊時采用Kruskal-Wallis檢驗。

3 結果

3.1 心肌血管新生

表1圖1顯示，單個高倍視野下apr-YTF組和rhG-CSF組的心肌毛細血管數較模型組顯著增加(P＜0.01);與香丹組比較，apr-YTF組的心肌毛細血管數增加有顯著性意義(P＜0.01)，rhG-CSF組亦有增加(P＜0.05);apr-YTF組和rhG-CSF組之間比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。

表1 各組間單個高倍視野平均毛細血管數(400×視野下計數)比較

表1 各組間單個高倍視野平均毛細血管數(400×視野下計數)比較

注:與模型組比較:＊＊P＜0.01;與香丹組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組別n血管數(條/視野)模 型 組85.38±1.69香 丹 組 8 7.13±3.14 rh-〗CSF組 8 11.00+4.44＊＊△apr-YTF組 8 14.13+3.18＊＊△△

3.2 各組心肌梗死邊緣區CD34+細胞、Ⅷ因子、Flk-1、VEGF、bFGF的表達

表2顯示，apr-YTF組、rhG-CSF組和模型組比較，CD34+細胞、Flk-1、bFGF表達增加，差異顯著(P＜0.01)，2組的Ⅷ表達亦增加(P＜0.05)，apr-YTF組的VEGF表達與模型組的差異顯著(P＜0.01)，rhG-CSF組的VEGF表達較模型組亦增加(P＜0.05);與香丹組比較，apr-YTF組和rhG-CSF組的CD34+表達增加顯著(P＜0.05)，Flk-1的增加亦有顯著性意義(P＜0.01);apr-YTF組和rhG-CSF組比較，各指標差異均無顯著性意義(P＜0.05)。

4 討論

急性心肌梗死的心肌修復過程與血管狀態密切相關，梗死區內是否有血管迅速生成和(或)殘留血管的重新開放，對心肌梗死的預后有十分重要的作用[6]。血管新生是指從已存在的血管上形成毛細血管，它是在組織損傷、傷口愈合、組織缺氧等病理情況下維護血管正常功能的一種反應。血管新生與內皮細胞高度相關。VEGF是高度特異性的血管內皮生長刺激因子，能特異性地作用于血管內皮細胞，刺激其增殖，促進側支血管的形成;bFGF是一種強的血管源性生長因子，可刺激成纖維細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞及神經細胞的生長，兩者對促進血管新生具有協同作用。Flk-1是VEGF的受體，對于血管新生以及維持內皮細胞存活具有重要意義[7]。Ⅷ因子為血管內皮細胞特異性蛋白。MSCs移植能通過上調移植細胞及受者內源性VEGF、Flk-1和bFGF的表達，促進血管新生，進而改善缺血心臟功能[8、9]。

圖1 各組心肌梗死邊緣區masson’s染色(×400)

本研究觀察到，apr-YTF組較模型組CD34+的表達量及陽性細胞數增加，CD34+是MSCs的特異性標志，因此說明apr-YTF能促進外周血MSCs歸巢于梗死心肌。心肌梗死區的毛細血管數及心肌梗死邊緣區的Ⅷ因子、Flk-1、VEGF、bFGF的表達含量，apr-YTF組均較模型組有所增加，表明這些細胞因子的分泌增加能促進血管新生，而這種細胞因子的分泌增加也與apr-TF促進MSCs的歸巢有密切關系。rhG-CSF是公認的促進MSCs分化的誘導劑，能提高心肌缺血者周圍循環中(外周血)MSCs標志物CD34+細胞含量(增加15～20倍)和MSCs向受損心肌的歸巢率[10]。本研究觀察到，apr-YTF組和rhG-CSF組在各指標方面均高于模型組(P＜0.05)，但二者之間的差異無統計學意義，說明二者在促進MSCs歸巢、促進血管新生細胞因子分泌方面的作用接近。

表2 各組心肌梗死邊緣區CD34+、Ⅷ因子、Flk-1、VEGF、bFGF表達(IOD值)的比較

表2 各組心肌梗死邊緣區CD34+、Ⅷ因子、Flk-1、VEGF、bFGF表達(IOD值)的比較

注:與模型組比較:P＜0.05，＊＊P＜0.01;與香丹組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n CD34+細胞 Ⅷ因子Flk-1 VEGF bFGF模 型 組 8 19.72±18.35 48.94±28.67 19.41± 8.47 394.16±262.83 190.84±67.47香 丹 組 8 26.74±13.90 55.99±17.30 18.90± 4.58 973.99±560.75* 160.39±130.14 rhG - CSF 組 8 43.18+20.35＊＊△ 76.98±16.12* 35.59±13.99＊＊△△ 830.55±288.48* 657.39±234.41＊＊apr - YTF 8 43.82± 8.04＊＊△ 75.37±21.97* 35.45+14.9＊＊△△ 966.61±399.27＊＊ 515.05±324.79＊＊

apr-YTF是由人參、丹參、枳實、澤瀉、桂枝等組成的養心通脈方中提取到人參總皂甙、人參總多糖、總丹參酮等多類有效成分部位，并通過對各有效成分部位的有效劑量配伍抗心肌缺血實驗研究研制而成。研究顯示，apr-YTF可改善冠狀循環，增加冠狀微循環血流量;增強心血管內皮細胞的抗血栓性，抑制凝血活性，調節脂質代謝，具有對抗心骯缺血再灌注損傷、防止氧自由基的毒害和增加機體的胰島素敏感性等作用[11～13]。因此，推測apr-YTF主要是通過促進血管新生細胞因子的分泌來改善心肌微循環血供，從而形成一個有利于KSCs歸巢和存活的微環境。

課題組在造模過程中觀察到，結扎冠脈而急性缺血梗死的心臟搏動明顯減弱、顏色變蒼白，術后活動遲緩、食量下降，模型組最甚，香丹組略好，而apr-YTF組則諸癥改善最佳，說明益氣活血的該方對微觀辨證為“氣虛血瘀”的大鼠療效優于“行氣活血”的香丹注射液，而促進細胞因子的分泌和血管新生，促進同MSCs歸巢于梗死心肌是這個療效的主要機理之一。

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