燈盞花素抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷誘導的細胞凋亡＊

龔明玉，周曉慧，張 力，陳亞靜

(1.承德醫學院生化教研室，河北 承 德 067000;2.承德醫學院附屬醫院放療科，河北 承 德 067000)

冠心病是導致人類死亡的主要原因[1]。在急性心肌梗死后，采用溶栓治療、經皮冠狀動脈介入術(PC I)或冠狀動脈旁路移植術(CABG)以早期恢復心肌再灌注是縮小梗死范圍和改善臨床轉歸的最有效方法。但動物模型研究提示，致死性再灌注損傷最多可占心肌梗死最終體積的50%[2]。研究發現，燈盞花素具有擴張血管、降低血液黏滯度、改善微循環、防治血栓形成的作用，可有效地預防氯化鋇、腎上腺素過量所導致的心律失常[3]。本研究通過用大鼠在體心臟模擬臨床缺血再灌注損傷病理變化，觀察燈盞花素是否具有抗凋亡等保護心肌的作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 燈盞花素注射液(吉林龍泰制藥股份有限公司)，TUNEL檢測試劑盒(Roche公司)。β-actin、caspase-3兔抗鼠多克隆抗體(美國Santa公司)，BCA蛋白定量試劑盒(上海生工)。

1.1.2 動物 健康SD大鼠40只，體重220g±20g，雌雄各半(購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司，許可證號scxk津2009-001)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 40只SD大鼠隨機分為燈盞花素I組、燈盞花素II組、正常對照組和缺血再灌注組4組，每組10只。4組大鼠均制備心肌缺血再灌注模型，其中燈盞花素2個組大鼠于手術前1周分別腹腔注射不同劑量的燈盞花素(25mg·kg－1·d－1、50mg·kg－1·d－1)，連用7d;正常對照組和缺血再灌注組術前分別給予相應容積的生理鹽水，時間同燈盞花素組。

1.2.2 心肌缺血再灌注模型的制備 10%烏拉坦腹腔注射麻醉(1ml·100g－1)大鼠，仰臥位固定，用針型電極插入大鼠四肢皮下記錄標準肢體II導聯心電圖。于胸骨左緣3～4肋間切開胸壁，暴露心臟，在左心耳與肺動脈干之間結扎左冠狀動脈前降支，同時在結扎線與血管之間穿一直徑2mm、長5mm的硅膠管，結扎30min;然后剪斷縫合線，取出硅膠管，再灌注2h，正常對照組僅分離前降支，但不結扎。

1.2.3 心肌細胞凋亡的TUNEL染色 ①按照試劑盒說明書操作如下:石蠟切片常規脫蠟，新配置的3%H2O2溶液室溫放置10min以封閉內源性過氧化物酶(POD)，蛋白酶K(25μg/mL)37℃消化30min，加TUNEL混合液，濕盒37℃ 60min，加ulcon-POD，37℃30min，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。標記前用DNA酶處理切片做陽性對照，用標記液代替TUNEL反應液做陰性對照;②檢測內容:陽性細胞核和(或)細胞碎片呈深淺不一的棕黃色，每張切片隨機選取10個視野(×400倍)，記數凋亡陽性細胞，以凋亡指數(apoptosis index，AI)作為凋亡程度的指標。AI=(視野內凋亡細胞個數/視野內所有細胞個數)×100%。

1.2.4 蛋白印記法檢測Caspase-3蛋白的表達

心肌組織蛋白提取，取心肌組織約100mg加入冰預冷的適量細胞裂解液，制成心肌細胞勻漿。冰上裂解40min，4℃12000rpm/min，離心20min收集上清，按照BCA蛋白定量試劑盒說明進行蛋白定量測定。采用蛋白印記法檢測Caspase-3蛋白的表達，上樣量90μg，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至PVDF膜上;一抗稀釋濃度1∶200，ECL檢測試劑盒顯影、洗片。以β-actin(1∶200稀釋)雜交作為內對照。膠片經掃描儀掃描后獲得圖像。用Bandleader 5.0軟件進行灰度分析，計算目的蛋白條帶與βactin的灰度比值。

1.3 統計分析

2 結果

2.1 燈盞花素對缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響

表1圖1顯示，TUNEL染色陽性產物位于細胞核，呈棕黃色顆粒狀。缺血再灌注組的AI值顯著高于對照組(P＜0.01)，燈盞花素I、II組的AI值低于缺血再灌注組(P＜0.05，P＜0.01)，說明燈盞花素可以抑制缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡。

2.2 Western blotting檢測Caspase-3蛋白表達情況

表1 各組大鼠心肌細胞凋亡指數比較

表1 各組大鼠心肌細胞凋亡指數比較

注:與正常對照組比較:﹡﹡P＜0.01;與缺血再灌注組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 給藥劑量(mg·kg－1·d－1)AI正 常 對 照 組 —4.24±0.96缺 血 再 灌 注 組 — 15.78±2.09﹡﹡燈盞花素Ⅰ組 25 13.97±1.98▲燈盞花素Ⅱ組 50 10.55±1.27▲▲

表2圖2顯示，與正常對照組大鼠相比，缺血再灌注組大鼠Caspase-3蛋白表達顯著升高(P＜0.01);與缺血再灌注組大鼠比較，燈盞花素組大鼠Caspase-3蛋白表達明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，差異具有顯著性。

圖1 燈盞花素對心肌缺血再灌注各組大鼠心肌細胞凋亡的影響(×400)

表2 燈盞花素對大鼠心肌細胞Caspase-3蛋白表達的影響

表2 燈盞花素對大鼠心肌細胞Caspase-3蛋白表達的影響

注:與正常對照組比較:﹡﹡P＜0.01;與缺血再灌注組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 給藥劑量(mg·kg－1·d－1)灰度比值Caspase-3/β-actin正 常 對 照 組 —0.461±0.008缺 血 再 灌 注 組 — 0.711±0.016﹡﹡燈 盞 花 素 Ⅰ 組 25 0.697±0.014▲燈盞 花 素 Ⅱ 組 50 0.548±0.012▲▲

圖2 燈盞花素對大鼠心肌細胞Caspase-3蛋白表達的影響

3 討論

近年來，減輕心肌缺血-再灌注損傷一直是心臟病學應用基礎研究中的一個熱點課題。研究發現，心肌缺血再灌注過程可誘導細胞凋亡，細胞凋亡是MIRI的特征之一，并與心肌遲發性死亡關系密切，細胞凋亡的多少決定著缺血再灌注損傷的輕重[4、5]。馮全洲等[6]發現，在大鼠實驗性心肌缺血后可引起細胞凋亡;趙明中等[7]在大鼠心肌缺血/再灌注時發現心肌細胞凋亡。細胞凋亡是受基因調控的有序的細胞非炎癥性死亡，藥物預處理干預心肌細胞凋亡被認為是預防和治療再灌注損傷的一條新途徑[8]。燈盞花素是從中藥燈盞花中分離得到的黃酮類化合物，現代藥理研究表明，燈盞花素具有擴張血管、改善微循環、抗凋亡等作用[9]。本研究結果顯示，與正常對照組相比，缺血再灌注組的心肌細胞凋亡指數明顯增加，燈盞花素組的心肌細胞凋亡指數較缺血再灌注組明顯降低，表明燈盞花素具有抑制再灌注心肌細胞凋亡的作用。

細胞凋亡是由基因控制的主動性死亡過程，與某些凋亡相關基因的調節與表達有關。Caspase是一個特殊的蛋白水解酶家族，全稱是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，其與心肌細胞凋亡的關系是近年來研究的熱點之一。在眾多Caspase成員中，Caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的關鍵蛋白酶。Caspase-3引起DNA損傷修復酶降解，同時激活核酸內切酶，從而使細胞凋亡[10、11]。徐強[12]等研究大鼠再灌注不同時相Caspase-3激活與心功能變化的關系提出，Caspase-3激活是MIRI后心肌細胞凋亡導致心功能下降的機制之一。本實驗通過對心肌細胞的Caspase-3蛋白表達水平的檢測，顯示缺血再灌注組的細胞Caspase-3蛋白表達明顯增加，當給予大鼠燈盞花素后，心肌細胞Caspase-3蛋白表達明顯下降。根據以上實驗結果，提示燈盞花素可以抑制再灌注心肌細胞的凋亡而具有心肌細胞的保護作用，其作用機制可能是通過下調Caspase-3蛋白的表達來實現的。

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