2型糖尿病大鼠不同組織中p85mRNA及蛋白表達(dá)變化與中藥干預(yù)作用＊

宋菊敏，舒 適，劉小美，宋麗娜

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

胰島素抵抗引起2型糖尿病的分子機(jī)制非常復(fù)雜。某些胰島素抵抗與胰島素受體突變有關(guān)，然而大多數(shù)胰島素抵抗可能主要由靶組織(肝臟、肌肉、脂肪)的胰島素受體后信號傳導(dǎo)分子的缺陷所引起。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)途徑是胰島素信號傳導(dǎo)的主要胞內(nèi)途徑，PI3K是刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取的重要介導(dǎo)分子[1]。PI3K由p85調(diào)節(jié)亞基和p110催化亞基組成，其中p85調(diào)節(jié)亞基可能在胰島素信號傳導(dǎo)過程中起到更為重要的作用。復(fù)方黃連降糖片在臨床上有較好的降血糖作用，為進(jìn)一步了解其降血糖和治療糖尿病的可能作用機(jī)制，以及p85在胰島素信號傳導(dǎo)中可能起到的作用，我們對此進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 動物

選用10周齡左右的清潔級健康雌性Wistar大鼠90只，由上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體重250g±20g。每籠5只，自由飲水和攝食，光照明暗周期12 h，室溫21℃±1℃，濕度50℃±10%。

1.2 藥品及其配制

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購自美國Sigma公司，臨用前以0.1mol/L濃度、pH 4.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成2%濃度STZ溶液。高脂飼料配方由基礎(chǔ)飼料55%、豬油16%、蛋黃粉2%、綿白糖27%組成，總熱量為19.93kj/g，正常飼料總熱量為16.20kj/g。復(fù)方黃連降糖片由黃連、大黃、肉桂等中藥煎液而成。鹽酸二甲雙胍片(商品名美迪康，深圳市中聯(lián)制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H44024853)用蒸餾水配成懸濁液，濃度為51.6mg/ml。

1.3 試劑及儀器

Rt-PCR所用試劑均為美國Fermentas公司產(chǎn)品，p85兔抗大鼠一抗為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗和DAB試劑盒均為武漢博士德公司產(chǎn)品，PCR9600擴(kuò)增儀，復(fù)日Smart View生物電泳圖像分析系統(tǒng)，DYCZ-24D型雙垂直電泳槽及DYY-TC型電轉(zhuǎn)移電泳槽。引物序列:p85上游引物5’-GCATCGGAGGCTTATCGG-3’，下游引物5’-GAGGGTTTGGG TGGCAGT-3’，產(chǎn)物長度為332bp;β-Actin上游引物5’-GTGGGGCGCCCC AGGCACCA-3’，下游引物5’-CTTCCTTAA TGTCACGCACGATTTC-3’，產(chǎn)物長度為540bp。

1.4 造模及分組

Wistar大鼠共90只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，其中設(shè)正常組15只，其余75只按照28mg/kg體重腹腔注射2%STZ溶液。造模第14天測定空腹血糖和糖負(fù)荷2h血糖，以空腹血糖測定結(jié)果為準(zhǔn)(7mmol/L-10mmol/L)，參考2h血糖隨機(jī)分為模型組、中藥小、中、大劑量組和西藥組各13只。分組后，正常組飼以基礎(chǔ)飼料，其余各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)。

1.5 給藥方法

正常組和模型組每日以2.0ml飲用水灌胃，小、中、大劑量組每日均以復(fù)方黃連降糖片煎液灌胃，其灌胃濃度分別為0.75ml(0.5g生藥/ml)、1.5ml(0.5g生藥/ml)、1.5ml(1.0g生藥/ml)，分別相當(dāng)于成人用量的6倍、12倍、24倍;西藥組每日以鹽酸二甲雙胍懸濁液1.0ml(51.6mg/ml)灌胃，相當(dāng)于成人用量的12倍。用藥8周測定空腹血糖、糖負(fù)荷2h血糖和空腹血清胰島素后處死大鼠，取其肝臟、右側(cè)腓腸肌及大網(wǎng)膜脂肪備用。

1.6 測定方法

1.6.1 血糖 采用葡萄糖氧化酶法測定。

1.6.2 血清胰島素 采用放射免疫雙抗體法測定。

1.6.3 p85mRNA表達(dá) 按Trizol說明書方法提取各組織總RNA，測定RNA濃度后，取2μgRNA經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為2×PCR mix12.5μl，上、下游引物各1μl(5μmol/L)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，DEPC水8.5μl;反應(yīng)條件為94℃3min;94℃40s，58℃1min，72℃1min，40個循環(huán);72℃5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照，Smart View分析凝膠圖像，得出目的基因和內(nèi)參基因的亮度掃描比值。

1.6.4 p85蛋白表達(dá) 各組織總蛋白的提取參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第3版[2]的蛋白提取方法，應(yīng)用組織裂解液裂解各組織得到組織總蛋白。取少量用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。從各組織所獲蛋白樣品經(jīng)8%SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)膜致PVDF膜后以5%脫脂奶粉封閉，再分別與1∶200稀釋的一抗和1∶2000稀釋的二抗反應(yīng)，再用DAB顯色，最后用凝膠成像儀拍照，Smart View分析顯色圖像得出掃描密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 成模情況

75只大鼠造模后成模65只，另有10只未成模大鼠被剔除。65只成模大鼠被分到模型組，中藥小、中、大劑量組和西藥組各13只。

2.2 各組大鼠治療前后空腹血糖和糖負(fù)荷2h血糖的變化

表1顯示，治療前與治療8周模型組與正常組之間空腹血糖均有顯著差異(P＜0.01)，治療前各組空腹血糖與模型組均無顯著差異。治療8周后各治療組空腹血糖與模型組比較均有顯著差異(P＜0.01)。治療前與治療8周模型組與正常組之間比較，2h血糖均有顯著差異(P＜0.01)。治療前，各組2h血糖與模型組均無顯著差異。治療8周時，中藥中劑量組與模型組比較2h血糖顯著下降(P＜0.05)，其他各組均未見顯著差異。

表1 各組大鼠治療前后空腹血糖和糖負(fù)荷2h血糖變化表

表1 各組大鼠治療前后空腹血糖和糖負(fù)荷2h血糖變化表

注:與正常組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n 治療前空腹(mmol/L)治療后空腹(mmol/L)治療前2h(mmol/L)治療后2h(mmol/L)正 常 組15 5.84±1.56 5.84±0.48 6.04±0.63 6.14±0.50模 型 組 13 7.76±2.64△△ 8.58±2.17△△ 11.17±6.13△△ 10.13±4.29△△小 劑 量 組 13 7.35±1.47 6.62±1.29＊＊ 11.37±4.50 9.01±2.29中 劑 量 組 13 7.36±1.38 6.85±0.71＊＊ 10.71±2.84 7.89±0.71*大 劑 量 組 13 7.30±1.24 6.73±0.62＊＊ 10.70±3.93 10.54±4.23西 藥 組 13 7.27±1.74 6.14±0.88＊＊10.49±3.77 8.62±1.94

2.3 各組大鼠血清胰島素的變化

表2顯示，模型組和正常組比較，大鼠血清胰島素顯著升高(P＜0.05);各用藥組與模型組相比，中藥大劑量組和西藥組血清胰島素濃度顯著降低(P＜0.05)，其他各組僅有降低趨勢，但沒有顯著差異。

表2 各組大鼠血清胰島素變化表

表2 各組大鼠血清胰島素變化表

注:與正常組比較:△P＜0.05;與模型組比較:*P＜0.05

組別n血清胰島素(μU/ml)正 常 組15 38.13±21.93模 型 組 13 58.66±25.09△小 劑 量 組 13 43.81±28.07中 劑 量 組 13 39.79±15.83大 劑 量 組 13 34.57±25.21*西 藥 組 13 34.21±23.38*

2.4 各組大鼠肝臟p85mRNA及蛋白表達(dá)變化

表3圖1顯示，各組大鼠肝臟p85mRNA表達(dá)的變化與正常組比較，模型組p85mRNA的表達(dá)顯著減少(P＜0.01);各用藥組與模型組比較，各組的p85mRNA表達(dá)均較模型組顯著升高(P＜0.05)。

圖1 大鼠肝臟p85mRNA表達(dá)電泳圖

表3 各組大鼠肝臟p85基因表達(dá)變化表

表3 各組大鼠肝臟p85基因表達(dá)變化表

注:與正常組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05

組別 n mRNA表達(dá)(目的/內(nèi)參比值)蛋白表達(dá)(密度)正 常 組60.53±0.08 1.59±0.19模 型 組 6 0.30±0.04△△ 1.13±0.14△△小 劑 量 組 6 0.45±0.16* 1.31±0.15中 劑 量 組 6 0.44±0.10* 1.33±0.15*大 劑 量 組 6 0.46±0.15* 1.33±0.16*西 藥 組 6 0.47±0.13* 1.34±0.20*

表3圖2顯示，各組大鼠肝臟p85蛋白表達(dá)的變化與正常組比較，模型組p85蛋白表達(dá)顯著減少(P＜0.01);與模型組比較，中劑量組、大劑量組和西藥組p85蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，小劑量組雖有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 各組大鼠骨骼肌p85mRNA及蛋白表達(dá)變化

圖2 大鼠肝臟p85蛋白表達(dá)電泳圖

表4圖3顯示，各組大鼠骨骼肌p85mRNA表達(dá)的變化:與正常組比較，模型組p85mRNA的表達(dá)顯著減少(P＜0.01);各用藥組與模型組比較，中劑量組和西藥組的p85mRNA表達(dá)較模型組顯著升高(P＜0.01，P＜0.05)，另外2中藥組有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 各組大鼠骨骼肌p85基因表達(dá)變化表

表4 各組大鼠骨骼肌p85基因表達(dá)變化表

注:與正常組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n mRNA表達(dá)(目的/內(nèi)參比值)蛋白表達(dá)(密度)正 常 組60.86±0.21 1.33±0.12模 型 組 6 0.35±0.07△△ 0.94±0.14△△小 劑 量 組 6 0.44±0.18 1.14±0.17*中 劑 量 組 6 0.69±0.25＊＊ 1.22±0.16＊＊大 劑 量 組 6 0.58±0.26 1.18±0.15＊＊西 藥 組 6 0.63±0.11* 1.19±0.15＊＊

圖3 大鼠骨骼肌p85mRNA表達(dá)電泳圖

圖4 大鼠骨骼肌p85蛋白表達(dá)電泳圖

表4圖4顯示，各組大鼠骨骼肌p85蛋白表達(dá)的變化:與正常組比較，模型組p85蛋白表達(dá)顯著減少(P＜0.01);與模型組比較，小劑量組p85蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，中劑量組、大劑量組和西藥組升高更為顯著(P＜0.01)。

2.6 各組大鼠脂肪p85mRNA及蛋白表達(dá)變化

表5圖5顯示，各組大鼠脂肪p85mRNA表達(dá)的變化:與正常組比較，模型組p85mRNA的表達(dá)顯著減少(P＜0.001);與模型組比較，中劑量組和西藥組的p85mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，另外2組有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 大鼠脂肪p85mRNA表達(dá)電泳圖

圖6 大鼠脂肪p85蛋白表達(dá)電泳圖

表5 各組大鼠脂肪p85基因表達(dá)變化表

表5 各組大鼠脂肪p85基因表達(dá)變化表

注:與正常組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n mRNA表達(dá)(目的/內(nèi)參比值) 蛋白表達(dá)(密度)正 常 組60.80±0.16 1.50±0.03模 型 組 6 0.50±0.07△△ 1.16±0.07△△小 劑 量 組 6 0.58±0.14 1.25±0.16中 劑 量 組 6 0.66±0.10* 1.33±0.06*大 劑 量 組 6 0.58±0.07 1.38±0.06＊＊西 藥 組 6 0.65±0.08* 1.41±0.11＊＊

表5圖6顯示，各組大鼠脂肪p85蛋白表達(dá)的變化:與正常組比較，模型組p85蛋白表達(dá)顯著減少(P＜0.001);與模型組比較，中劑量組、大劑量組和西藥組p85蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，小劑量組有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

PI3K由含SH2區(qū)的p85調(diào)節(jié)亞基和具有酶活性的p110催化亞基組成。在胰島素的刺激下，胰島素受體與胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)結(jié)合并使其活化，隨后p85亞基通過SH2結(jié)構(gòu)域與IRS相結(jié)合，當(dāng)2個SH2結(jié)構(gòu)均被磷酸化后，p110的活性達(dá)到最大。P110被激活后，催化一系列磷酸肌醇磷酸化，從膜磷脂中產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，后者作為胰島素的第二信使，與含有PH區(qū)段的下游分子結(jié)合將信號下傳，調(diào)節(jié)肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞對葡萄糖的攝取以及糖原合成、抗脂肪分解等其他多種生物學(xué)效應(yīng)[3]。

復(fù)方黃連降糖片是上海名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，由黃連、大黃、肉桂組成，以清熱瀉火為主，兼有活血化瘀之功效，加肉桂能制黃連和大黃之苦寒，防止苦寒傷陰，又能引火歸元，使陰平陽秘，達(dá)到陰陽平衡。三藥配伍，使火熱得清，津液得存，又無苦寒傷陰之弊。我們以往的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，其對糖尿病動物模型有良好的降糖、調(diào)脂作用，并能降低血清胰島素水平，升高KK小鼠肝臟、脂肪細(xì)胞InsRmRNA的表達(dá)以及脂肪、骨骼肌細(xì)胞GLUT4mRNA的表達(dá)[4、5]。為更進(jìn)一步了解其降糖、改善胰島素抵抗的分子機(jī)制，我們對2型糖尿病大鼠不同組織中p85基因表達(dá)的變化進(jìn)行了研究。

本次實(shí)驗(yàn)中，模型大鼠出現(xiàn)高血糖、高胰島素血癥等典型2型糖尿病胰島素抵抗癥狀，提示我們用小劑量STZ合并高脂飲食造模是成功的。此外，實(shí)驗(yàn)動物不同組織的p85亞基，無論是其mRNA或是蛋白，在2型糖尿病模型中的表達(dá)均顯著較正常對照組減少。p85作為PI3K的主要組成部分及p110與IRS間的橋梁，其表達(dá)缺陷可能造成胰島素信號傳導(dǎo)PI3K途徑的障礙，使胰島素的信號在細(xì)胞內(nèi)的傳遞減少或者減慢，最終引起高血糖和高胰島素血癥等糖尿病胰島素抵抗癥狀。在用復(fù)方黃連降糖片等藥物干預(yù)治療后，在糖尿病癥狀顯著改善的同時，2型糖尿病模型大鼠肝臟、骨骼肌與脂肪組織中的p85亞基的表達(dá)均有顯著提高，其中以蛋白表達(dá)的改善更為顯著，同時3個組織當(dāng)中又以骨骼肌p85基因的表達(dá)提高最為顯著。以上結(jié)果提示，該復(fù)方對2型糖尿病胰島素抵抗的治療作用可能與它們能提高不同組織中p85基因的表達(dá)而改善胰島素的信號傳導(dǎo)有關(guān)。

[1]金 丹，陸付耳.PI3-K在2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(1):21-23.

[2]J薩姆布魯克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].金冬雁，黎孟楓，張 勵，等譯.第2版.北京:科學(xué)出版社，1993.881-887.

[3]楊亞超，周玉萍，王顏剛.胰島素抵抗的信號傳導(dǎo)障礙[J].中國臨床康復(fù)，2004，8(30):6747-6749.

[4]劉小美，宋菊敏，劉麗瓊，等.復(fù)方黃連降糖片對2型糖尿病模型大鼠肝臟低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的影響[J].山東中醫(yī)雜志，2006，25(1):838-841.

[5]宋菊敏，劉小美，孔祥亮，等.復(fù)方黃連降糖片(糖尿?qū)?治療2型糖尿病闡析[J].上海中醫(yī)藥雜志，2008，42(5):24-25.