固本活血壯骨顆粒對去卵巢大鼠血清IGF-1和IL-1β影響的實驗研究＊

田丙坤，邢玉瑞△，張 丹

(1.陜西中醫學院，陜西 咸 陽 712046;2.陜西中醫學院2007級碩士研究生)

骨質疏松癥相當于中醫學骨痿、腰痛、骨痹、骨折、虛勞等范疇。早在上世紀90年代，我們即提出骨質疏松癥的主要病機為腎虛、脾虛與血瘀，因而確立了補腎健脾活血為本病的治療大法[1，2]，創制了固本活血壯骨顆粒。經初步研究臨床療效顯著，且實驗表明，固本活血壯骨顆粒能夠有效提高去卵巢大鼠的骨密度，防治骨質疏松癥[3、4]。為進一步深入探討固本活血壯骨顆粒作用的微觀機制，本實驗擬以成骨細胞增殖強刺激因子胰島素樣生長因子1(IGF-1)和破骨細胞強刺激因子白介素1β(IL-1β)為指標，并結合上卵巢大鼠骨形態學改變，觀察固本活血壯骨顆粒對其影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級3月齡雌性SD大鼠60只，體重250g±20g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，動物許可證號2007-001。

1.2 藥物

固本活血壯骨顆粒(主要由淫羊藿、杜仲、鹿角膠、黃芪等組成)，由陜西中醫學院中藥制劑研究室生產，每1g含生藥2g。大鼠給藥量按文獻方法折算[5]，用蒸餾水將藥物配成每毫升含生藥0.2g(小劑量)、1g(大劑量)(大小劑量為 1 ∶5)混懇液，置4℃冰箱中備用。尼爾雌醇片(批準號國藥準字H11020123，北京四環制藥有限公司)，用蒸餾水配成0.1g/ml混懸液備用。仙靈骨葆膠囊(成分:淫羊藿、續斷、丹參、知母、補骨脂、地黃。批準號國藥準字Z20025337，貴州同濟堂制藥有限公司)，用蒸餾水配成0.05g/ml混懸液備用。氯化鈉注射液(批準號國藥準字H61020014，西安京西雙鶴藥業有限公司);注射用青霉素鈉(國藥準字 H 23021439，哈藥集團制藥總廠)80萬單位/瓶。

1.3 試劑

中性福爾馬林配制方法:40%甲醛100ml，無水磷酸二氫鉀 4 .0g，Na2HPO46.5g加蒸餾水 9 00ml。乙二胺四乙酸液(EDTA)配制方法:EDTA5.5g，10%中性福爾馬林100ml，用NaOH調整pH為7.0。大鼠血清IGF-1和IL-1β定量測定試劑:ELISA試劑盒購白上海西唐生物科技有限公司，為美國R＆D分裝試劑。

1.4 主要儀器

LEICARM2135切片機(Leica公司)，YB-6LF包埋機(孝感市亞光醫用電子技術有限公司);DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標儀(芬蘭Thermo公司);Wellwash 4 MK2洗扳機(芬蘭Thermo公司);PYX-DHS型數字顯示隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠);XW-80A漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠);PYX-YDA-35*40 37℃恒溫油電二用恒溫培養箱(上海市躍進醫療器械一廠);Nikon eclipse E200生物顯微鏡(日本Nikon公司)等。

2 方法

2.1 分組

將60只大鼠試驗性飼養1周無異常后，隨機分為6組(n=10):假手術組、模型組、仙靈骨葆膠囊組、尼爾雌醇組、固本活血壯骨顆粒小劑量組(0.938g/kg，簡稱小劑量組)、固本活血壯骨顆粒大劑量組(4.69g/kg，簡稱大劑量組)。

2.2 造模

禁食12h后，以1%戊巴比妥鈉40mg/kg劑量作腹腔注射麻醉。麻醉生效后，參考文獻[5]。其中，假手術組切除雙側卵巢附近的相當與卵巢大小的小塊脂肪，其余組切除雙側卵巢。術后每天每只給予青霉素5萬單位，連續3d，防止感染。

2.3 給藥方法

喂養1周，開始灌胃。灌胃量:固本活血壯骨顆粒小劑量組為0.938g/kg、大劑量組為4.69g/kg、仙靈骨葆膠囊組為0.469g/kg，1次/d。尼爾雌醇組灌尼爾雌醇混懸液10ml/kg，1次/w。假手術組、模型組灌生理鹽水10ml/kg，1次/d。藥物劑量每周按體重校正1次。

2.4 取樣

游胃90d后處死大鼠。處死前日晚禁食，翌日8∶00采用心臟取血方式取血6ml，然后將其以3000r/min離心15min分離血清，置抗凝管內，存于－20℃冰箱保存待測IL-1β、IGF-1水平。取右側股骨，鈍性分離附著的肌肉組織，標記后置于10%甲醛溶液固定。

2.5 測定指標

血清IGF-1、IL-1β水平測定，由上海西唐生物公司檢測，采用ELISA定量測定法，嚴格按照試劑盒使用說明操作。血清1次解凍，同步測試，在同一實驗室內完成測定。

2.6 骨組織HE染色及觀察

大鼠右脛骨以10%的中性福爾馬林液固定48h，置入pH7.0 EDAT中脫鈣30d，至股骨軟化有彈性，脫鈣成功后取材(右脛骨上端縱橫兩個切面)，沖水24h，依次酒精上行脫水(70%～80%～90%～95%～100%)、透明、石蠟包埋，4μm厚連續切片，進行HE染色，光鏡下觀察各組大鼠骨組織態學的變化。

2.7 統計方法

所得數據采用SPSS15.0軟件進行統計分析。血清IGF-1和IL-1β結果均用進行描述，統計學分析采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

3 結果

3.1 大鼠血清IGF-1水平

表1顯示，與A組比較，B組IGF-1水平降低，并且差異有顯著性(P＜0.05);各藥物組與B組比較，IGF-1水平均高于B組，其中D、F組較B組差異有顯著性(P＜0.05)。

表1 IGF-1

表1 IGF-1

注:與A組比較:*P＜0.05;與B組比較:★P＜0.05

組別 n 血清IGF-1(ng/ml)假 手 術 組(A)10 74.374±19.051模 型 組 ( B ) 10 60.696±17.598*尼 爾 雌 醇 組(C) 10 61.544±18.824仙靈骨葆膠囊組(D) 10 69.084±18.365★小 劑 量 組 (E ) 10 64.324±19.867大 劑 量 組 (F) 10 72.518±21.500★

3.2 大鼠血清IL-1β 水平

表2顯示，與A組比較，B組IL-1β水平升高，且差異有顯著性(P＜0.05);與B組比較，各組IL-1β水平均低于B組，其中D、F組較B組差異有顯著性(P＜0.05)。

3.3 各組大鼠骨組織顯微結構變化

圖1～圖6顯示，A組骨小梁結構緊密，小梁粗大均勻，骨連續性好;B組骨小梁明顯稀疏、細小、萎縮及斷裂，骨髓腔徑擴大，骨連續性差;C、D、E、F組骨形態均有所改善，骨小梁結構較緊密，數量增加，骨髓腔徑縮小，骨連續性較好，其中以D、F組最為顯著，已接近A組。

表2 各組大鼠血清IL-1β

表2 各組大鼠血清IL-1β

注:與A組比較:*P＜0.05;與B組比較:★P＜0.05

組別 n 血清IL-1β(pg/ml)假 手 術 組(A)10 3.530±0.879模 型 組 ( B ) 10 5.690±1.870*尼 爾 雌 醇 組 (C) 10 5.658±0.779仙 靈 骨 葆 膠 囊 組(D) 10 3.038±1.083★小 劑 量 組 (E ) 10 4.965±1.255大 劑 量 組 (F ) 10 3.776±0.768★

4 討論

骨組織的形成需要經過間充質干細胞、骨原細胞、成骨細胞、骨細胞等一系列細胞的增殖、分化，很多細胞因子參與調節成骨細胞的增殖活動，如IGF-1、IL-1β。研究表明，IGF-1可促進細胞增殖、分化，抑制凋亡，是促進骨形成的重要因素[6]。IGF-1與絕經后骨質疏松及其引起的骨折有著密切的關系，可作為一種更加準確且易于檢測的骨代謝標志物預測骨質疏松和骨折的發生[7]。IL-1β主要由單核細胞、巨嗜細胞分泌組成，能損傷軟骨細胞，抑制軟骨細胞的增殖[8]，IL-1β具有損失、抑制軟骨細胞增殖的作用[9]。

從實驗結果看，模型組與假手術組比較，IGF-1水平降低，IL-1β水平升高，結果有顯著性差異性(P＜0.05)，且骨形態有明顯的病理性改變，提示模型組大鼠成骨細胞增殖受抑制，破骨細胞增殖活躍，骨丟失明顯，說明造模成功。用藥組與模型組比較，均提高了IGF-1水平，降低了IL-1β水平，改善了骨形態。其中尼爾雌醇組和小劑量組與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)，說明其對骨質疏松癥的治療效果不明顯，此結果與前期實驗結果一致。仙靈骨葆膠囊組和大劑量組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，骨形態改善明顯，而小劑量組與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)，說明固本活血壯骨顆粒的作用與劑量存在一定量效關系，須達到一定濃度才能使藥效達到顯著性。

骨質疏松癥屬于中醫學“骨痿”范圍，主要與腎虛、脾虛和血瘀有關。其病機特點可概括為本虛(先后天之本脾腎兩虛)夾瘀(血行遲緩)的多系統、多臟器的全身性骨骼疾病，治療大法是固本(補腎填精、益氣健脾)活血，以達到壯骨止痛的目的。固本活血壯骨顆粒以鹿角膠、杜仲、仙靈脾補腎助陽、填精壯骨為君藥，輔之以黃芪益氣健脾為臣，三七等活血止痛為佐藥，既培補先后天以充腎精，又達到補中寓通、標本兼治的目的。

研究結果表明，固本活血壯骨顆粒通過提高成骨細胞增殖因子IGF-1水平，降低破骨細胞分化因子IL-1β水平，使骨代謝負平衡狀態得以糾正，從而改善骨組織顯微結構，對去卵巢大鼠的骨質疏松癥具有防治作用;此作用與藥物濃度有著正相關性，下一步實驗需進一步探討其量效關系。

[1]張喜德，邢玉瑞，田丙坤.骨質疏松癥常用中藥及其選配規律探析[J].陜西中醫學院學報，1999，22(5):43-44.

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[3]田丙坤，邢玉瑞，張喜德.補腎健脾活血法對去卵巢大鼠骨質疏松癥的影響[J].陜西中醫學院，2001，24(6):49-52.

[4]李翠娟，張喜德，邢玉瑞，等.固本活血壯骨顆粒對去卵巢大鼠骨質疏松癥的影響[J].中國中醫基礎醫學雜志，2004，10(8):14-17.

[5]施新猷.現代醫學實驗動物學[M].北京:人民軍醫出版社，2000.380.

[6]吳田英，王麗珍，古桂雄.胰島素樣生長因子Ⅰ研究與進展[J].中國兒童保健雜志，2008，16(3):320-322.

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