頭針促進MCAO模型大鼠腦微血管新生的動態觀察＊

張慧敏，趙萬標，張志強，時宇靜

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京 100038;2.中國中醫藥報社，北京 100085;3.中國中醫科學院，北京 100700)

局灶性腦缺血病后的康復已引起臨床神經病學家的重視并取得了很大的進展，頭針是治療缺血性腦卒中的理想方法之一，具有簡單易行、經濟有效等特點，不僅可以有效改善神經功能缺損評分[1]和缺血性中風模型的多項指標，并參與腦血管內皮細胞損傷狀態的調整和恢復，促進血管新生。然而目前臨床及科研主要集中在治療切入時機的研究，而療程觀察相對較少，本文選用頭穴百會透刺曲鬢穴方法，采用不同針刺療程，從血管新生的角度，研究其對腦缺血損傷的保護機制及其介入治療時限的相關性，從而為臨床治療提供依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級健康雄性Wistar大鼠，12周齡，體重300g±20g，由中國軍事醫學科學院實驗動物中心提供。大鼠于飼養廚內適應性飼養1周，清潔飲水，自由攝食。光照與黑暗為12h交替，室溫為20℃～22℃，相對濕度60%。

1.2 動物模型建立

模型的制作，根據1985年Koizumi[2]在日本腦卒中會議上首次報道的在大鼠用尼龍線進行可逆性大腦中動脈阻塞模型方法。采用4～0號尼龍漁線(日本株式會社生產)，頭端加熱成圓球形，直徑約0.3mm，經硅化后晾干備用。麻醉后的大鼠取仰臥位固定。頸部正中切口，分離并暴露一側頸總動脈及頸內、外動脈，在頸內、外動脈分叉處結扎頸外動脈，在近心端結扎頸總動脈，并在其遠端預置一結扎線。在頸總動脈結扎處遠端約3mm處剪一小口，將直徑為0.24mm的尼龍線從切口導入，經頸內動脈入顱內分叉部時，即可阻斷流入大腦中動脈的血流，進線長度約18±0.5mm，之后將頸總動脈連同尼龍線一起結扎。術后創面敷少許抗生素(先鋒Ⅳ)，縫合傷口，注意動物保暖，術后大鼠單籠飼養觀察。

1.3 動物分組

所有實驗組動物在MCAO清醒(術后約30min)后，在1h～2h內觀察模型動物神經癥狀行為障礙的程度，依據Bederson[3]行為學評分法，采用雙盲法評分，進行實驗動物神經功能評價。具體方法為:①無神經損傷癥狀0分;②不能完全伸展對側前爪1分;③向對側轉圈2分;④向對側傾倒3分;⑤不能自發行走，意識喪失4分。測評分符合1～3分的動物為納入動物，余下剔除。實驗組大鼠造模后符合納入標準的動物隨機分為模型組與頭針組，每組依據治療療程的不同分為1D、3D、5D、10D 4個時間段，每時間段各8只，每組32只。假手術組除不進行線栓阻塞外，其余手術步驟同模型組[1]。

1.4 針刺治療

針刺選穴與操作:選取大鼠百會、曲鬢穴，采用直徑0.25×25mm毫針常規消毒，病灶側百會透刺曲鬢，針體與皮膚成15°角至帽狀鍵膜下，深約10mm。針后捻轉每分鐘200轉，每根針捻轉1min，重復2次，留針30min。首次針刺在造，模術后6h開始，治療各組療程分別為1、3、5、10D，每日1次。空白對照組和模型組各組動物每天同樣抓取1次，不做其他處理。

1.5 免疫組化實驗

1.5.1 取材 各組實驗大鼠分別在規定的時間點，以10%水合氯醛(0.3ml/kg體重)腹腔麻醉后，從左心室插管灌注，先給予0.9%生理鹽水50ml灌注后，行4%的多聚甲醛300ml灌注25min，注畢取出大腦并置于4%多聚甲醛液中后固定過夜。

1.5.2 標本處理 于冰盤上迅速分離全腦去除嗅球、小腦及腦干，于視交叉前2.0mm處向后冠狀切取4.0mm厚度的腦組織，待做常規免疫組化標本。

1.5.3 免疫組化染色法 一抗由北京中山生物技術有限公司代理的美國Santa Cruz生物技術公司提供;二抗采用北京中山生物技術有限公司代理的美國DAKO公司的EnVision試劑盒。具體步驟如下:(1)脫蠟、水化組織切片;(2)3%過氧化氫孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶;(3)根據所應用一抗的特殊要求，對組織切片進行預處理;(4)滴加FⅧR:Ag一抗，4℃過夜，PBS沖洗，2min×3;(5)增加試劑EnVision，37℃孵育20min，PBS沖洗，2min×3;(6)應用 D AB溶液顯色，采用 D AKO顯色劑;(7)蒸餾水沖洗、復染、脫水、封片。

1.5.4 圖像分析 在200倍鏡下，每張切片在缺血側海馬CA3區隨機選取5個視野，用北航多功能真彩色病理圖像分析管理系統(CMIAS2001A型)進行定量分析，分別測量缺血側海馬CA3區微血管內皮陽性細胞黃褐色反應物的總面積、積分光度，分析FⅧR:Ag的表達情況。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 光鏡下觀察各組微血管內皮FⅧR:Ag表達結果

新生的血管是由單層扁平上皮細胞構成的，免疫組化DAB顯色后，新生的血管內皮細胞的胞漿呈棕黃色，胞體扁平，呈單層管樣排列，有的基底膜完整，有的不完整甚至無基底形成。實驗所選定的模型1d組、3d組與正常組、假手術組及針刺1d組未見新生血管;針刺組3d開始有新生血管生成，5d生成血管數量明顯增加，10d達高峰;而模型組5d開始有新生血管生成，10d血管新生明顯，但明顯少于針刺組(見附圖1)。

2.2 圖像分析針刺對腦微血管內皮FⅧR:Ag表達的影響

缺血各時段假手術組FⅧR:Ag表達的總面積、積分光密度與正常組比較未見明顯改變(P＞0.05)，模型組動物海馬CA3區表達FⅧR:Ag的總面積、積分光密度均較假手術組及正常組明顯升高(P＜0.05)。提示正常腦血管內皮細胞可少量表達FⅧR:Ag，腦缺血后缺血海馬CA3區陽性血管內皮細胞FⅧR:Ag表達明顯增加。

表1顯示，模型組與假手術組比較各個不同療程的陽性細胞數明顯增多，有極顯著性差異(P＜0.01)，說明線栓法局灶性腦缺血模型成功;而同療程針刺組與模型組比較，針刺1D組與模型1D組比較無顯著性差異(P＞0.05)，針刺3D、5D組分別與模型3D、5D組比較有顯著性差異(P＜0.05)，針刺10D組與10D組比較有極顯著性差異(P＜0.01)。

表1 各組實驗大鼠FⅧR:Ag表達的總面積

表1 各組實驗大鼠FⅧR:Ag表達的總面積

注:與同時段模型組比較:★P＜0.05，★★P＜0.01;與假手術組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

Group n 1D 3D 5D 10D Normal 8 80.35±2.63 80.35±2.63 80.35±2.63 80.35±2.63 Sham 8 80.53±2.71 80.53±2.71 80.53±2.71 80.53±2.71 Model 8 84.25±5.13 88.88±6.32 95.16±5.37▲ 112.47±5.02▲Treatment 8 85.42±4.98 92.41±4.97★ 98.49±4.87★ 118.61±4.73★★

表2 各組實驗大鼠FⅧR:Ag表達的積分光密度

表2 各組實驗大鼠FⅧR:Ag表達的積分光密度

注:與同時段模型組比較:★P＜0.05，★★P＜0.01;與假手術組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

Group n 1D 3D 5D 10D Normal 8 43.51±3.96 43.51±3.96 43.51±3.96 43.51±3.96 Sham 8 44.43±4.07 44.43±4.07 44.43±4.07 44.43±4.07 Model 8 45.51±4.01▲▲ 49.59±3.97▲▲ 54.52±4.33▲▲ 72.42±4.09▲▲Treatment 8 45.49±4.44 46.52±3.87★ 50.99±4.67★ 65.44±4.78★★

表2顯示，模型組與假手術組比較各個不同療程的陽性細胞數明顯增多，有極顯著性差異(P＜0.01)，說明線栓法局灶性腦缺血模型成功;同療程針刺組與模型組比較，針刺1D組與模型1D組比較無顯著性差異(P＞0.05)，針刺3D、5 D組與模型3D、5D組比較有顯著性差異(P＜0.05)，針刺10D組分別與模型10D組比較有極顯著性差異(P＜0.01)。提示正常腦缺血海馬CA3區內皮細胞FⅧR:Ag可少量表達，腦缺血經針刺治療后缺血海馬CA3區微血管內皮細胞FⅧR:Ag積分光密度表達明顯增加，并呈持續效應。

3 討論

缺血性腦血管病遺留的神經功能障礙一直是困擾人類醫學的難題。腦缺血后神經元的修復不僅與營養因子、生長相關因子表達等有關，還取決于缺血區血管新生營造的微環境[4]。血管新生是指在機體生長發育過程中或創傷修復、缺血缺氧和炎癥等情況下，原有微血管內皮細胞經過生芽、遷移、增殖與機制重塑等形成新毛細血管的過程[5]。血管新生是微血管系統對缺血損傷做出能動反應的標志。微血管的完整性需要內皮細胞通透屏障和基底膜來共同維持。內皮細胞緊密連接及胞飲作用形成首要屏障[6]。當血管內皮受損時，遺傳性假血友病因子(von willebrand’s factor，vWF)的合成大量增加并釋放入血流中，可作為血管內皮損傷的標志。目前國際上認為，vWF是在TIA、微血栓形成及大多數缺血性卒中的一個有效的獨立危險因素。凝血因子Ⅷ是由凝血蛋白和vWF所組成的復合物，具有抗原性，又稱因子Ⅷ相關抗原(FⅧR:Ag)。FⅧR:Ag主要由內皮細胞合成，分布于血管內皮細胞Weikel-palabe小體，也分布于血小板膜內。vWF增高是心腦血管事件的獨立預測因子，凡是有血管內皮細胞損害的病變如腦卒中等，均可見血漿中FⅧR:Ag水平增高[7]。而用免疫組化方法顯示的FⅧR:Ag只在新生血管上表達，因此不僅能測定出血灶內FⅧR:Ag的相對含量，同時也可作為新生血管的標記。FⅧR:Ag是公認的最特異、最常用的血管內皮細胞標記抗原，FⅧR:Ag表達陽性強度說明新生血管形成程度[8]。本試驗結果顯示，1D模型組與針刺組無顯著差異，而3D、5D組有顯著差異，10D組有極顯著差異，并與有關文獻基本一致[9]，說明頭穴針刺可促進缺血后微血管新生，對治療腦血管病有良好的作用且有持續治療意義。其中模型組內1D、3D與10D組比較有差異，說明有一定的自愈傾向，但組間比較差異顯著，說明自愈程度有限，仍需積極治療。

總之，通過本研究對頭穴針刺在不同時間段上FⅧR:Ag指標的動態考察，可以認為頭穴針法可激活內皮細胞，促進腦缺血后腦微血管的新生，對指導臨床救治缺血性腦血管疾病有顯著意義。而這種在療效上的顯著意義，隨著最佳介入時間內療程的適度延長更具有顯著相關性。

[1]張慧敏.頭針對局灶性腦缺血腦微血管內皮細胞ICAM-1影響的動態觀察[J].現代生物醫學進展，2007，5(7):682-684.

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[3]Bederson J B，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion，evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17(3):472-473.

[4]王 娟，劉 健，王 舒，等.腦缺血后血管新生及針刺作用的研究進展[J].中華中醫藥學刊，2009，7(27):1477-1480.

[5]謝佳佳，賓建平.靶向超聲分子成像評價血管新生的研究進展[J].中國醫學影像學雜志，2010，1:75-77.

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[7]Cortellaro M，Boschetti C，Cofrancesco E，et al.The PLAT study:hemostatic function in relation to atherothromotic ischemic events in vascular disease patients[J].Arterioscler Thromb，1992，12(9):1063-1070.

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[9]馬璟曦，羅 勇.針對大鼠局灶腦缺血再灌注后腦內血管生長因子和血管抑制因子表達的影響[J].中國針灸，2007，27(2):129-133.