利用LC/MS/MS方法檢測附子水提液中烏頭堿的含量方法學研究＊

馬 芳，趙 東，吳曉霞，閆 寒，范 斌，竇德強，彭 娟，聶穎蘭，郭 娜，于友華△

(1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大 連 116620;2.中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700)

附子為毛莨科草本植物烏頭 Aconitum carmichaeli Debx.子根的加工品，其加工品又可分為鹽附子、黑附片(黑順片)、白附片、淡附片、炮附片。始載于《神農本草經》，辛、甘，大熱、有毒，歸心、腎、脾經，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛之功效。現代藥理研究表明，附子有強心、增加血管血流量、升血壓、抗炎、促進免疫等作用[1～5]，在臨床也有廣泛的應用。由于附子中雙酯型生物堿類成分的治療劑量和中毒劑量非常接近[6～7]，所以檢測附子水提液中這類生物堿的含量非常重要，有關附子中雙酯型生物堿含量測定的報道比較多[8～10]，但這些方法均采用的是HPLC法測定。眾所周知，附子中雙酯類生物堿是其含量限定的成分，固含量較低，利用HPLC方法檢測所需藥材較多且用時較長。本文建立的檢測附子水提液中烏頭堿的LC/MS/MS方法，在8min內出峰，方法快速靈敏。

1 材料

1.1 藥物及試劑

烏頭堿(A0196)購于微科生物科技有限公司，白附片產地四川，批號0090414，由中國中醫科學院中藥研究所何希榮主管藥師鑒定為毛莨科多年生草本植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品。無水乙醇(分析純)、乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)均購于北京迪科馬科技有限公司。

1.2 儀器

Agilent 6410 QQQ LC-MS分析系統(美國Agilent RRLC液相色譜儀;Agilent 6410 QQQ三重四級桿質譜檢測器;Masshunter工作站)，賽多利斯ariumR61316/611VF超純水處理器，賽多利斯BT25S分析天平，多功能提取罐。

2 附子水提液含量測定方法學考察及含量測定

2.1 色譜條件

液相條件:Agilent ZORBAX C18SB(2.1×100mm 1.8-Micron);流動相:A.水(0.05%FA)，B.乙腈，A∶B=72∶28(V/V)，梯度洗脫:0min～2min，B.28%～34%;2min～6min，B.34%～35%;6min～10min，B.35%～100%;流速為0.35mL·min－1;柱溫:40℃。

質譜條件:正離子模式，MRM，烏頭堿m/z 646.4→586.4，利用以上色譜條件分析得到烏頭堿對照品的總離子流圖(TIC)(圖1)及其在附子水提液中的TIC圖(圖2)。

圖1 對照品烏頭堿的TIC圖

圖2 附子水提液中烏頭堿的TIC圖

2.2 附子水提液的制備

白附片1kg加入10L水浸泡12h后，回流提取3次，每次2h，合并水提液，減壓濃縮，最后得生藥量為1g·mL－1的附子水提液。

2.3 供試品溶液的制備

精取附子水提液，稀釋100倍后取1mL，精密加入8倍量無水乙醇渦旋，在4℃下靜置24h抽濾，定容至100mL容量瓶中，超聲混勻、濾過，待測。

2.4 線性關系

精密稱取烏頭堿對照品，配制0.011、0.023、0.045、0.09、0.180、0.360、0.720ng·mL－1一系列濃度的對照品溶液，按2.1的色譜條件進樣分析。以峰面積Y對濃度X進行回歸處理得到烏頭堿的回歸方程Y=3804.200X－73.576(r=0.9978)。

2.5 精密度試驗

按2.3制得的樣品連續進樣6次，記錄各組分的峰面積，計算6次的標準偏差(RSD)，得到日內精密度，按2.3制得的同一樣品連續進樣6 d，記錄各組分的峰面積，得到日間精密度，結果見表1。

2.6 重復性試驗

表1顯示，按2.3平行制備6份樣品，按2.1的色譜條件進樣分析，記錄各組分的峰面積。

2.7 加樣回收率試驗

表1顯示，采用加樣回收法，取樣品適量加入烏頭堿適量，按上述條件測定。

表1 精密度、重復性及加樣回收率考察

2.8 樣品穩定性

將制備好的供試品溶液于0、2、4、6、8、10、12、24h進樣分析，考察供試品溶液當天的穩定性，表明供試品溶液在24h內穩定。

2.9 附子水提液的含量測定

對附子水提液按2.3項下制備，測得濃度為0.185 ng·mL－1。

3 討論

本方法利用LC/MS/MS方法對附子水提取液中烏頭堿進行了含量測定，比傳統方法快速、準確且靈敏。

[1]陳長勛，金若敏.用血清藥理學實驗方法觀察附子的強心作用[J].中國中醫藥科技，1996，3(3):12-14.

[2]馬宗超，唐智宏，張 海.談附子的藥理及臨床應用[J].時珍國醫國藥，2004，15(11):790.

[3]韓 濤.附子湯對心血管藥理的作用研究[J].山東中醫學院學報，1992，16(5):33-36.

[4]王勝林，董耀榮.附子水煎液對心梗后心力衰竭大鼠血流動力學的影響[J].陜西中醫，2007，28(6):745-748.

[5]張俊平，楊衛平.附子對慢性充血性心力衰竭模型大鼠NO、TNF-α水平的影響[J].浙江中醫藥大學學報，2009，33(1):38-42.

[6]楊世雷.附子的毒性及應用[J].中國現代藥物應用，2009，3(3):76-77.

[7]張為亮，徐楚江.附子毒效關系的實驗研究[J].廣西中醫藥，1997，20(3):43-44.

[8]魏玉輝，王曉華，沈明謙，等.藤藥中烏頭堿含量測定HPLC方法的建立[J].中成藥，2008，30(1):130-131.

[9]劉玉蘭，劉世坤，裴 奇，等.高效液相色譜法測定附子中3組分的含量[J].中國藥房，2006，17(16):1255-1256.

[10]王 瑞，孫毅坤，王 耘，等.高效液相色譜法測定附子及其炮制品中三種雙酯型生物堿[J].現代生物醫學進展，2007，7(7):1078-1080.