不同濃度醇提取淫羊藿功效成分的研究

嚴躍進，沈 勇，黃 偉，金燕敏，張蒞峽

(海南亞洲制藥有限公司藥物研究所，浙江 金 華 321017)

淫羊藿為常用中藥，為小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(Epimedium)多種植物的干燥地上部分。始載于《神農本草經(jīng)》，別名仙靈脾。《本草綱目》中記載:莖葉入藥，辛溫無毒，具有“益精氣，堅筋骨，補腰腎，強心力”等功效[1]。現(xiàn)代研究證明，淫羊藿苷、淫羊藿總黃酮、淫羊藿多糖是淫羊藿的主要有效成分。此外，尚還有生物堿、甾醇、卅一烷及維生素E等[2、3]，其主要有補腎壯陽、祛風濕、抑制微生物、擴張冠脈、抗衰老、促進骨細胞生長以及促進免疫等作用[4～6]。本文針對淫羊藿提取工藝研究中經(jīng)常遇到的問題，采用不同濃度乙醇用冷滲漉法，考察了其提取工藝對淫羊藿苷、淫羊藿總黃酮及淫羊藿總多糖含量的比較研究。

提取淫羊藿中的主要成分——淫羊藿苷、總黃酮類及多糖等，通常采用的方法有乙醇熱回流法、乙醇滲漉法、堿提取法、水提醇沉法等。但是由于在乙醇熱回流法中，需要反復加熱、多次回流，水提醇沉法中因為濃縮時間過長，這些都會使有效成分被破壞，無效雜質成分增多;在堿提取法中，提取和濃縮時，會發(fā)生苷類成分堿水解，使有效成分提取量減少。這些方法都有不足之處。所以我們采用乙醇冷滲漉的方法，選用不同濃度乙醇(20%、50%、70%和95%)，采用相同流速滲漉，以3個定量指標進行對比試驗，以選取最佳乙醇提取濃度。這樣可以使苷類成分損失較少，并且有效成分很少會被破壞，應當說這是最理想的提取方法

1 材料

SK3200H型超聲處理器(120W，59HZ)(上海科導超聲儀器有限公司);高效液相色譜儀(HPLC)HP-1100型(Agilwnt Technologies);色譜柱Kromasil C18(250×4.6mm 5mm serial:8511233);紫外分光光度計(島津UV-2550);電子天平FA1004(上海精料天平公司);淫羊藿苷(中國藥品生物制品鑒定所，批號0737-9709);D-無水葡萄糖(中國藥品生物制品鑒定所，批號110833-200302);用于HPLC法測定的試劑均為色譜純，水為重蒸餾水;用于分析的試劑均為分析純，水為蒸餾水;淫羊藿(購于四川綿陽，經(jīng)鑒定為箭葉淫羊藿)。

2 方法

2.1 冷浸-滲漉提取法

經(jīng)過多次預試驗并結合實際情況，我們設計了4個試驗點:分別為20%、50%、70%和95%4個不同濃度乙醇提取液，作為選擇以下相同實驗條件，分段進行提取。

各稱取500g經(jīng)粉碎過篩的淫羊藿樣品，用設計濃度的乙醇潤濕2h，浸泡20h，并分別以上述濃度乙醇作為溶媒，按6.0ml/kg.mim的流速，滲漉至體積為3000ml(每取500ml滲漉液為1份，同濃度下按先后依次編號1#～6#)。分別減壓濃縮直至干燥，得提取物稱重(結果見表1及圖1)，測淫羊藿苷(結果見表2及圖2)及淫羊藿總黃酮(結果見表3及圖3)。最后各用3000ml水滲漉，得水滲漉液，減壓濃縮、干燥，得提取物、稱重，測總多糖(結果見表4及圖4)。

表1 4種乙醇濃度提取的提取物重量(g)

圖1 4種濃度乙醇提取的提取物重量

2.2 生藥的含量測定

2.2.1 方法 按照《中國藥典》2005年版淫羊藿項下的檢測方法[7]。

2.2.2 結果 測得淫羊藿苷的含量為0.69%，淫羊藿總黃酮含量是7.11%，表明藥材符合《中國藥典》規(guī)定。

2.3 醇提取中淫羊藿苷、淫羊藿總黃酮以及水提取中總多糖的測定

2.3.1 淫羊藿苷的含量測定(高效液相色譜法)色譜條件:色譜柱:Kromasil C18(250×4.6mm 5mm serial:8511233);流動相:乙腈-水(30∶70);流速:1.0ml/min;柱溫:30℃;檢測波長:UV270nm;進樣量:10μl。

對照品溶液制備及標準曲線:精密稱取淫羊藿苷對照品13.29mg，至25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取1ml～5ml至10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度搖勻。按上述色譜條件進樣，以樣品濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標。繪制標準曲線，得回歸方程A=81212C－158.36，r=0.9991，表明淫羊藿苷濃度在0.05316－0.2658mg/ml范圍內與峰面積呈良好線性關系。

淫羊藿苷測定用供試溶液的制備及測定:精密稱取樣品約0.2g，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20ml稱定重量，超聲處理1h再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻、濾過取續(xù)濾液即得。隨后在上述條件下測定并計算得結果(詳見表2及圖2)。

表2 不同乙醇濃度從淫羊藿中提取淫羊藿苷的重量(g/500ml)

圖2 不同乙醇濃度從淫羊藿中提取淫羊藿苷的重量(g/500ml)

2.3.2 淫羊藿總黃酮的含量測定(紫外分光光度法)紫外條件:島津UV-2550型分光光度計，檢測波長:UV270nm。

對照品溶液制備及標準曲線:精密稱量取淫羊藿苷對照品13.29mg，至25ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。即得對照品溶液。精密量取對照品溶液0.3、0.5ml及1～6ml，分別至50ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度搖勻。以甲醇為空白，270nm波長處測定樣品中淫羊藿總黃酮吸收度。以樣品濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標。繪制標準曲線，得回歸方程A=40.79379C－0.00135，r=0.9994，表明淫羊藿總黃酮濃度在0.0031896-0.063792mg/ml范圍內與吸收度呈良好線性關系。

淫羊藿總黃酮測定用供試溶液的制備及測定:精密量取淫羊藿苷測定項下供試溶液0.5ml，置50ml容量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，作為供試溶液。隨后在上述條件下測定并計算結果(詳見表3及圖3)。

表3 4種不同乙醇濃度的提取物中總黃酮的重量(g/500ml)

2.3.3 總多糖的含量測定(DNS法)紫外條件:島津UV-2550型分光光度計，檢測波長UV520nm。

對照品溶液制備及標準曲線:精密稱量在105℃干燥恒重的無水葡萄糖對照品約50mg，置于50ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度搖勻，即得對照品溶液。經(jīng)0.45μm濾膜過濾，棄取初濾液，取續(xù)濾液5ml，置于25ml容量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻。以水為空白，520nm波長處測定樣品中淫羊藿總多糖吸收度。以樣品濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標。繪制標準曲線，得回歸方程A=5.67840C－0.22923，r=0.9992，表明淫羊藿總多糖濃度在0.04659-0.23296mg/ml范圍內與吸收度呈良好線性關系。

圖3 不同乙醇濃度從淫羊藿中提取淫羊藿總黃酮的重量(g/500ml)

還原糖供試品的制備:精密稱取約35mg，置25ml容量瓶中，加水20ml超聲處理，使完全溶解，定容至刻度，搖勻、濾過，取續(xù)濾液即得。

總多糖供試品的制備:精密稱取約35mg，置50ml容量瓶中，加鹽酸溶液(1－＞2)10ml，置沸水浴中10min取出，放冷后加40%氫氧化鈉調PH至中性，加水至刻度搖勻、濾過，取續(xù)濾液即得。

表4 不同濃度乙醇處理后水提取物中總多糖含量(%)

總多糖的測定:精密量取上述對照品溶液，還原糖和總糖供試液各2ml。分別置10ml容量瓶中，各加入3，5-二硝基水楊酸試液1.5ml搖勻，置沸水浴中加熱5min取出，立即放入冰水中冷卻30min后，加水至刻度搖勻，在上述條件下測定并計算得結果(見表4及圖4)。

圖4 不同濃度乙醇處理后水提取物中總多糖含量

3 小結

針對不同的提取要求，采用不同的乙醇濃度。經(jīng)過比較分析得出結論:提取淫羊藿苷為主時，宜選擇用70%乙醇濃度提取;提取淫羊藿總黃酮為主，選擇50%乙醇濃度為最佳;在相同得條件下，總多糖得提取則應該選擇用70%濃度乙醇提取后，再用水滲漉得方法。

4 討論

4.1 乙醇提取

圖1顯示:(1)20%和50%乙醇濃度提取時，當取滲漉液為3倍量時，達到最高值;(2)70%乙醇濃度提取時，滲漉液倍量呈線性降低趨勢;(3)50%和95%乙醇濃度滲漉出的醇溶物重量分別為最高和最低。

4.2 從淫羊藿中提取淫羊藿苷

圖2顯示:(1)50%和70%乙醇提取時，隨著滲漉液的不同，倍量呈線性降低趨勢;(2)20%和95%的醇濃度提取時，淫羊藿苷的重量較低;(3)70%乙醇濃度提取時，淫羊藿苷的總重量達到最高值。

4.3 從乙醇中提取淫羊藿總黃酮

圖3顯示:(1)50%乙醇提取時，取3倍量時淫羊藿總黃酮達到最高值;(2)70%乙醇提取時，隨著倍量的增加，總黃酮的重量呈線性速減;(3)20%和95%乙醇提取總黃酮時，總的重量較低;(4)用50%乙醇提取，總黃酮的總重量為最高。

4.4 水提物中提取總多糖

圖4顯示，70%濃度的乙醇提取時總多糖的損失較少，含量較高。95%乙醇提取后所得的水提物，黏性較大，得到總多糖的含量也較少。

[1]李時珍.本草綱目[M].第2冊.北京:人民衛(wèi)生出版社，1977.751.

[2]王昌林，李 昱，王粵新.淫羊藿及其有效成分的藥理研究概況[J].中醫(yī)中藥雜志，1988，23(3):183.

[3]雷載權，陳松育，高學敏.中藥學[M].上海:上海科學技術出版社，2001.288.

[4]閻愛榮，李愛軍.淫羊藿的現(xiàn)代藥理研究概述[J].傳統(tǒng)中藥研究，1999，2:62.

[5]蔡曼玲，季 暉，李 萍，等.5種淫羊藿黃酮類成分對體外成骨細胞的影響[J].中國天然藥物，2004，4:235.

[6]蔣麗君，夏新華.抗癡呆膠囊水提取工藝研究[J].湖南中醫(yī)學院學報，2000，20(2):26.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].2010年版一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，307.