姜黃素對人膀胱癌T24細(xì)胞增殖和凋亡的影響

孔 濤，楊靜哲，代宏亮，王成李，張志杰，李 巍，李以良，賈玉森

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院泌尿外科、男科，北京 100078)

傳統(tǒng)抗癌藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時，往往也引起正常細(xì)胞發(fā)生凋亡，所以近年來，從天然植物中尋找毒副作用小、安全有效的抗腫瘤藥物成為研究的熱點[1]。姜黃素為中藥姜黃的提取物，毒性低，有良好的抗癌防癌作用，美國FDA已將其作為21世紀(jì)抗癌新藥[2]。姜黃素能否抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，目前研究報道很少。本研究姜黃素對人膀胱癌T24增殖和凋亡的影響。

1 方法

1.1 細(xì)胞增殖實驗方法-四唑鹽比色法(MTT法)檢測細(xì)胞增殖抑制率

向傳代T24細(xì)胞加不同濃度姜黃素，按10、50、100、250、500μmol/L濃度分5組(姜黃素10，姜黃素50，姜黃素100，姜黃素250，姜黃素500)，設(shè)不加藥物的對照組，共6組。每組設(shè)平行重復(fù)5孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，以5×106/ml接種于96孔板，每孔200μl，貼壁生長后棄上清，每孔加入200μl新配制5mg/ml濃度的MTT，37℃繼續(xù)孵育4h，用平板離心機(jī)離心(3000r/min 10min)，棄上清加入150μl的二甲基亞砜，震蕩10min使結(jié)晶物充分溶解，用3022型酶標(biāo)儀，選擇490nm波長測定光吸收OD值。腫瘤細(xì)胞抑制率=(1－實驗孔測定值/對照孔測定值)×100%，并消除溶劑OD值的影響。

1.2 細(xì)胞凋亡實驗方法-流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

向傳代T24細(xì)胞加不同濃度姜黃素，按10、50、100、250、500μmol/L濃度分5組(姜黃素10，姜黃素50，姜黃素100，姜黃素250，姜黃素500)，設(shè)不加藥物的對照組，共6組。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，以5×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板上，每組5孔。貼壁生長后，用0.25%Trypsin溶液消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。固定:將細(xì)胞懸液離心(1000r/min 5～10min)棄上清，加入－20℃70%的乙醇5ml固定30min，－20℃冰箱保存。RNase和Pl染液染色后，流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖結(jié)果

表1顯示，四唑鹽比色法(MTT法)檢測細(xì)胞增殖抑制率。腫瘤細(xì)胞抑制率=(1－姜黃素孔測定值/對照孔測定值)×100%。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率

表2 各組細(xì)胞凋亡率

向體外培養(yǎng)的膀胱癌。T24細(xì)胞中施加10、50、100、250、500μmol/L濃度的姜黃素。測定各組細(xì)胞光吸收至值(OD值)，根據(jù)腫瘤細(xì)胞抑制率=(1－姜黃素孔測定值/對照孔測定值)×100%計算出腫瘤細(xì)胞抑制率。結(jié)果顯示，一是姜黃素各組增殖抑制率較對照組高，存在顯著性差異(P＜0.05);(2)在不同姜黃素劑量組，隨著藥物作用濃度的增加，增殖抑制率也明顯增加，存在顯著性差異(P＜0.05)及劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 細(xì)胞凋亡結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示對照組，姜黃素各組經(jīng)PI染色，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，每組檢測3次取均值，進(jìn)行比較。對照組的凋亡率為3.52%，姜黃素50組的凋亡率為12.16%，姜黃素100組的凋亡率為24.65%，姜黃素250組的凋亡率為42.74%，姜黃素500組的凋亡率為28.12%，姜黃素組與對照組凋亡率相比較，凋亡率增高，存在顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時在不同姜黃素劑量組，隨著藥物作用濃度的增加，凋亡率也明顯增加，存在顯著性差異(P＜0.05)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。

3 討論

脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基為姜科姜黃屬植物姜黃Curcumin longaL.的主要有效成分，具有多方面的藥理作用，如抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂及抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等。尤其是作為一種具有良好發(fā)展前景的抗癌藥物，其抗癌譜廣、毒副作用小，最近被腫瘤學(xué)家們認(rèn)為是一種潛在的第三代抗腫瘤藥，其作用日益引起人們的重視，成為當(dāng)前研究的熱點[3]。近期研究表明，它能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[4]，但對膀胱癌細(xì)胞的作用報道較少。

在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有劑量依賴性的抑制膀胱癌T24細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，且在一定的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。各組間差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明姜黃素的直接作用可在體外明顯抑制人膀胱癌T24細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡。在本實驗中，我們通過流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，姜黃素能夠誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡，50moL/L的小劑量姜黃素即可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞凋亡率隨著姜黃素濃度的增加而升高。而當(dāng)姜黃素劑量很高時(500mol/L)，細(xì)胞的凋亡率卻明顯降低，我們分析高濃度的姜黃素可能會造成部分細(xì)胞壞死，從而細(xì)胞凋亡率降低。可見在一定的濃度范圍內(nèi)，姜黃素能誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡，但姜黃素的濃度很高時同樣會造成細(xì)胞的病理性損害，因此選擇適當(dāng)濃度的姜黃素不但可以啟動膀胱癌T24細(xì)胞的“自殺”程序，而且可以避免藥物劑量過高造成的細(xì)胞壞死。

總之，通過研究我們認(rèn)為，姜黃素能夠顯著抑制人膀胱癌T24細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。

[1]鄒復(fù)慧，張 和.中藥抗腫瘤作用分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)·腫瘤學(xué)分冊，2005，32(1):l 7.

[2]Jee SH.Shen SC，Tseng CR，et al.Curcumin induces ap53-dependent apoptosis in human basal cell carcinoma cells[J].J Invest Dermatol，1998，111:656.

[3]Lin JK，Huang TS，Shih CA，et al.Molecular mechanism of action of curcumin[J].Food Phyto-Chemicals for Cancer PreventionⅡ.ACS Symposium Series，1994，547，pp.196-203.

[4]Hanif R，Qiao L，Shift SJ，et al.Curcumin，anatural plant phenolic food additive，inhibits cell proliferation and induces cell cycle changes in colon adenocarcinoma celllines by aprostagl and inindependent pathway[J].J Lab Clin Med，1 997，130:576.