RP-HPLC法測定人血漿中帕瑞昔布的濃度

李正翔，尹靜文，孫麗

（1.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津市 300052；2.泰山醫(yī)學院藥學院，泰安市 271016；3.天津醫(yī)科大學藥學院，天津市 300070）

RP-HPLC法測定人血漿中帕瑞昔布的濃度

李正翔1＊，尹靜文2，孫麗3

（1.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津市 300052；2.泰山醫(yī)學院藥學院，泰安市 271016；3.天津醫(yī)科大學藥學院，天津市 300070）

目的：建立測定人血漿中帕瑞昔布的方法。方法：采用反相高效液相色譜法，血漿以無水乙醚提取后進樣測定，色譜柱為Kromasil C18，流動相為乙腈-水（92∶8），內(nèi)標為布洛芬，流速為1.0mL·min－1，檢測波長為209nm，最小進樣間隔為30min。結(jié)果：帕瑞昔布血藥濃度在73.69～442.16μg·mL－1范圍內(nèi)線性關系良好（r＝0.9992）；方法回收率為97.26%～99.24%，提取回收率為79.27%～80.51%，日內(nèi)和日間RSD均≤2.10%。結(jié)論：本方法簡便、快速、準確、重復性好，可以滿足帕瑞昔布血藥濃度的測定要求。

反相高效液相色譜法；帕瑞昔布；血藥濃度；藥動學

非甾體抗炎藥（NSAIDs）通過抑制環(huán)氧化酶（COX），以減少花生四烯酸轉(zhuǎn)化成前列腺素（PG）等炎癥介質(zhì)，達到抗炎鎮(zhèn)痛的目的，是目前疼痛治療的常用藥物[1]。非選擇性的NSAIDs，雖能同時阻滯COX-1和COX-2，起到抗炎和止痛作用，但其胃腸道損害、腎臟損害和抑制血小板聚集等不良反應卻限制了其進一步使用。口服選擇性的COX-2抑制劑如塞來昔布和羅非昔布（幾年前默克制藥公司在全球自愿召回羅非昔布（萬絡））能有效緩解中度疼痛，減少胃腸道反應和抗血小板作用等不良反應的發(fā)生，但對術(shù)后惡心、嘔吐以及不能口服藥物的患者也不是理想選擇[2，3]。因此，帕瑞昔布——一種可以通過靜脈注射或肌肉注射途徑使用的特異有效COX-2抑制劑，可能是最佳選擇[4～6]。帕瑞昔布2008年底開始在中國上市，之前只有美國和印度有相關的使用記錄。在國內(nèi)，該藥的臨床藥動學數(shù)據(jù)還相對缺乏。因此，需要建立一種快速、簡便、準確的測定該藥血藥濃度的方法。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀及其工作站（戴安中國有限公司）；UV-260紫外檢測儀（日本島津公司）；800型離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）；LD5-2A離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；KQ218型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；YKH-Ⅲ型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）；CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）；通用型Adventurer分析天平（美國Ohaus公司）；YQ02.30型直聯(lián)旋片式真空泵（上海長江醫(yī)療器械廠）；101-A型數(shù)顯電熱鼓風干燥箱（上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司）；BS60電熱三用水箱（北京醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

對照品：注射用帕瑞昔布鈉（輝瑞制藥有限公司，批號：AGUKB-85820001，含量：100.5%）；內(nèi)標：布洛芬（中國藥品生物制品檢定所，批號：100.79-200303）；正常人空白血漿（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院輸血科提供）；氮氣（N2，六方高科技氣體廠，含量：99.999%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為市售分析純，純化水為天津醫(yī)科大學總醫(yī)院藥劑科自制。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250nm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（92∶8）；檢測波長：209nm，流速：1.0mL·min－1；柱溫：室溫；進樣量：20μL；最小進樣間隔：30min。

2.2 血漿樣品及溶液的制備

2.2.1 血漿樣品。將已加抗凝劑的正常血液置離心機上1500r·min－1離心10min，使血細胞與血漿分離，取上層血漿置于冰箱－20℃保存。使用時，室溫自然融化。

2.2.2 帕瑞昔布鈉對照品溶液。取干燥至恒重的注射用帕瑞昔布鈉約0.1g，準確稱定為0.12221g（含帕瑞昔布鈉0.12282g），置于100mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1.2282mg·mL－1帕瑞昔布鈉對照品溶液，置于2℃冰箱備用。用前閉塞超聲2min。

2.2.3 內(nèi)標溶液。取內(nèi)標布洛芬約0.05g，準確稱定為0.05161g，置于50mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1.0324mg·mL－1的內(nèi)標溶液，置于2℃冰箱備用。用前閉塞超聲2min。

2.3 正交試驗確定血漿樣品的處理方法

2.3.1 預試驗：取空白血漿0.5mL，依次加入帕瑞昔布鈉對照品溶液0.1mL、0.10mol·mL－1鹽酸溶液適量、內(nèi)標（1.0324mg·mL－1布洛芬）溶液0.1mL、乙醚適量。渦旋振蕩10min，1500r·min－1離心2min，取上清液于40℃水浴下N2揮干后，殘渣加入0.10mol·mL－1氫氧化鈉溶液，超聲溶解后，再次于60℃水浴下N2揮干，殘渣加入流動相2mL超聲溶解后，取20μL，按“2.1”項色譜條件進樣測定。結(jié)果，帕瑞昔布和內(nèi)標出峰時間均較適宜，且能達到良好的分離。

2.3.2 試驗方案。根據(jù)預試驗情況，確定考察因素為血漿樣品的pH值（A）（用鹽酸調(diào)節(jié)），加入的氫氧化鈉的體積與鹽酸體積的差值（B），乙醚量（C），每個因素安排3個水平進行優(yōu)選，試驗因素與水平見表1。

表1 試驗因素水平Tab1 Factors and levels

2.3.3 試驗結(jié)果。以確定的3因素3水平，按照L9（34）正交表的設計配制9份樣品，以帕瑞昔布的峰面積為指標，進行評定。正式試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果L9（34）Tab2 Results of L9（34）orthogonal test

如表2所示，通過極差分析可知，幾個因素對結(jié)果影響大小的順序是 C＞B＞A，且 A 因素：K1＞K2＞K3，B 因素：K1＞K3＞K2，C 因素：K2＞K1＞K3。所以最佳提取條件是 A1B1C2，即調(diào)節(jié)pH＝1、加堿量少于加酸量0.5mL、加乙醚4mL。

2.3.4 血漿樣品提取方法的確定。根據(jù)正交試驗，血漿樣品的處理方法為：取血漿0.5mL，用0.10mol·mL－1鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1，加入內(nèi)標（1.0324mg·mL－1布洛芬）溶液0.1mL，乙醚4mL，渦旋振蕩10min，1500r·min－1離心2min，取上清液于40℃水浴下N2揮干后，殘渣加入0.10mol·mL－1氫氧化鈉（比鹽酸量少0.5mL），超聲溶解后，再次于60℃水浴下N2揮干，殘渣加入流動相2mL超聲溶解后，取20μL進樣。

2.4 專屬性考察

吸取帕瑞昔布鈉對照品溶液0.12mL，加入到空白血漿0.5mL中，搖勻，配制成濃度為294.77μg·mL－1的血漿樣品。按“2.3.4”項下方法處理進樣，并與血漿樣品及空白血漿比較，結(jié)果，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾帕瑞昔布和內(nèi)標的測定。帕瑞昔布、內(nèi)標布落芬的保留時間分別為3.00、4.05min。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+帕瑞昔布對照品溶液+內(nèi)標；C.血漿樣品+內(nèi)標；1.帕瑞昔布；2.布洛芬Fig1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+parecoxib control+internal standard；C.plasma sample+internal standard；1.parecoxib；2.ibuprofen

2.5 標準曲線的制備

吸取帕瑞昔布鈉對照品溶液0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18mL，分別加入到空白血漿0.5mL中，搖勻，使其濃度分別為73.69、147.39、221.08、294.77、368.46、442.16μg·mL－1。按“2.3.4”項下方法處理，進樣測定，記錄色譜。用帕瑞昔布峰面積與內(nèi)標峰面積比（Y）對濃度（c）作線性回歸，得回歸方程Y＝0.0089c+0.2101（n＝5，r＝0.9992）。結(jié)果表明，帕瑞昔布血藥濃度在73.69～442.16μg·mL－1范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6 精密度試驗

吸取0.06、0.12、0.18mL的帕瑞昔布鈉對照品溶液，分別加入到空白血漿0.5mL中，搖勻，配制成濃度分別為147.39、294.77、442.16μg·mL－1的血漿樣品。按“2.3.4”項下方法處理，每個濃度的樣品分別于同日內(nèi)等時間間隔5次和連續(xù)5d內(nèi)5次提取進樣，測定，將所得峰面積比值（Y）用標準曲線計算出帕瑞昔布濃度（c），考察日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗結(jié)果（n＝5）Tab3 Results of precision tests（n＝5）

2.7 提取回收率試驗

按“2.6”項下方法，配制3種濃度的血漿樣品，按“2.3.4”項下方法處理，進樣測定，記錄色譜。將所得峰面積比值（Y），用標準曲線計算出帕瑞昔布濃度（c）。另相同濃度的帕瑞昔布鈉對照品溶液直接進樣后，將所得峰面積比值（Y′），根據(jù)標準曲線計算出帕瑞昔布濃度（c′）。用c與c′的比值計算提取回收率，結(jié)果見表4。

表4 提取回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab4 Results of extraction recovery tests（n＝5）

2.8 加樣回收率試驗

取空白血漿0.5mL，向其中加入帕瑞昔布鈉對照品溶液，配制成低、中、高3種濃度的血漿樣品。再分別向其中加入相當于血漿樣品含藥量80%、100%、120%的帕瑞昔布鈉對照品溶液，各平行制備5份，按“2.3.4”項下方法處理，記錄色譜。所得峰面積比值（Y），根據(jù)標準曲線計算出帕瑞昔布濃度（c），進而得到測得量。按公式（加樣回收率＝（測得量－血漿樣品中帕瑞昔布量）/對照品加入量×100%）計算加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab5 Results of recovery tests（n＝5）

2.9 穩(wěn)定性試驗

按“2.5”項所示，配制成濃度為294.77μg·mL－1的血漿樣品9份。放置于－20℃冰箱，分別于0、24、72h后自然解凍，每個間隔3個樣品，按“2.3.4”項下方法處理，測定，結(jié)果測得濃度分別為（326.25±9.38）、（313.54±13.68）、（317.54±5.4）μg·mL－1，其RSD＝2.04%。表明血漿中帕瑞昔布在－20℃條件下中穩(wěn)定。

3 討論

3.1 提取方法對色譜行為的影響

本試驗采用了液-液萃取的方法。由于所用藥品帕瑞昔布鈉為水溶性的藥物，故先將其酸化降低極性后，再用乙醚提取，可有效增大提取回收率；之后，再用氫氧化鈉堿化，揮干，可有效降低雜質(zhì)峰對帕瑞昔布峰的影響，并且改善峰形。本試驗通過正交試驗，得出用鹽酸調(diào)節(jié)樣品至pH＝1、加入的氫氧化鈉比鹽酸少0.5mL最為適宜。

3.2 色譜條件對色譜行為的影響

3.2.1 檢測波長的選擇。將對照品稀釋100倍，用紫外檢測儀在200～400nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)在209nm和243nm波長處均有較大吸收，209nm波長處為最大吸收，因此選擇209nm為檢測波長。

3.2.2 內(nèi)標的選擇。筆者考察了布洛芬，結(jié)果顯示，帕瑞昔布鈉在C18柱上的保留時間為3.0min左右，布洛芬的保留時間為4.0min左右，和帕瑞昔布峰的分離度（R）為5.5，分離效果較好，且布洛芬的出峰位置無雜質(zhì)峰干擾，符合生物樣品的測定要求。

3.2.3 流動相的選擇。考慮到價格因素，筆者嘗試了用甲醇作流動相，但帕瑞昔布峰的峰面積不隨濃度的增大而成倍增加，可能的原因是甲醇極性較低，帕瑞昔布鈉在其中的溶解程度較低，不能得到良好的分離洗脫。對于流動相的配比，筆者分別用乙腈-水（92∶8）、乙腈-水（95∶5）、乙腈-水（90∶10）、乙腈-水（88∶12）作為流動相進行試驗。結(jié)果，用乙腈-水（95∶5）作流動相，帕瑞昔布鈉與前面雜質(zhì)峰不能分開；用乙腈-水（88∶12）作流動相，帕瑞昔布鈉與后面雜質(zhì)峰不能分開；用乙腈-水（90∶10）作流動相，分離效果較好，但帕瑞昔布鈉峰形較鈍，均不符合測定要求。而用乙腈-水（92∶8）作流動相，峰形較好，且能達到良好的分離。

3.2.4 進樣間隔時間考察。筆者發(fā)現(xiàn)在26min左右還有峰出現(xiàn)，因此把最小進樣間隔時間定為30min。

3.3 對照品選擇

由于帕瑞昔布標準品無法獲得，所以采用已知含量的注射用帕瑞昔布鈉作為試驗對照品，文中所用數(shù)據(jù)均為經(jīng)標示量百分含量折算后的數(shù)值。

本試驗以布洛芬為內(nèi)標，采用無水乙醚提取揮干后進樣的反相高效液相色譜法測定人血漿中帕瑞昔布濃度。在流動相為乙腈-水（92∶8）、流速為1.0mL·min－1、檢測波長為209nm、最小進樣間隔為30min的色譜條件下，帕瑞昔布線性范圍為73.69～442.16μg·mL－1，線性關系良好，提取回收率較高，準確度和精密度較高。該法簡便、快速、準確、重復性好，可用于帕瑞昔布血藥濃度的測定。

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Concentration Determination of Parecoxib in Human Plasma by RP-HPLC

LI Zheng-xiang
（General Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China）
YIN Jing-wen
（School of Pharmacy，Taishan Medical College，Taian 271016，China）
SUN Li
（School of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the concentration determination of parecoxib in human plasma.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The plasma sample was extracted with absolute ether.The determination was performed on Kromasil-C18（250nm×4.6nm，5μm）column with mobile phase consisted of acetontrile-water（92∶8）at the flow rate of 1.0mL·min－1.Ibuproren（IBF）was used as internal standard and UV detection wavelength was set at 209nm.Minimum injection interval was 30min.RESULTS：The linear range of parecoxib was 73.69～442.16μg·mL－1（r＝0.9992）.The method recovery was 97.26%～99.24%and extraction recovery was 79.27%～80.51%.The RSD of intra-day and inter-day were less than 2.10%.CONCLUSION：The method is simple，rapid，accurate，reproducible and suitable for the determination of parecoxib concentration in human plasma.

RP-HPLC；Parecoxib；Plasma concentration；Pharmacokinetics

R969.1；R971+.1

A

1001-0408（2011）18-1675-03

＊主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學。電話：020-60363702。E-mail：Lee41@sina.com

2010-07-06

2011-03-01）